不同檢測系統血腎素和醛固酮結果一致性及對臨床診斷的影響分析*

杜超，牛長春，田華，李甜，李智杰，廖璞,

(1.重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶400016;2.重慶市人民醫院檢驗科 重慶市臨床檢驗中心，重慶400014)

根據《中國心血管病報告2018》[1]，我國心血管疾病處于持續上升階段，推算目前患者2.9億人，其中高血壓占2.7億人。高血壓可防可控，研究表明，降壓治療可降低腦卒中風險35%～40%，降低心肌梗死風險20%～30%，降低心力衰竭風險超過50%[2]。因此，高血壓早期的準確診斷并及時采取干預措施對于降低高血壓的并發癥及致死率有重要意義。在高血壓的早期診斷中，腎素(renin)、醛固酮(aldosterone)等已成為原發性和繼發性高血壓分型診斷、治療及研究的重要指標[3]。其中在繼發性高血壓應用中，尤其是在原發性醛固酮增多癥(primary aldosteronism，PA)篩查中，血漿腎素和醛固酮測定及其相關比值計算是關鍵的篩查依據[4-5]。目前腎素及醛固酮的檢測方法有放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)、化學發光免疫法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、液相色譜串聯質譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)。其中,CLIA應用最為廣泛，其可能原因是：與RIA相比，測定價值相當，甚至更優，并且具有快速、安全(無放射性)的程序和易于重復檢測的優勢[6-7]。CLIA包括國外和國內品牌，其中國外品牌以意大利索靈為代表，國產品牌以鄭州安圖、深圳新產業及深圳邁瑞等為代表。而隨著CLIA廣泛應用于臨床診療活動，關于不同化學發光檢測系統間的結果比較則報道較少，因此本研究借助重慶市臨床檢驗中心平臺優勢，旨在研究不同化學發光檢測系統血腎素及醛固酮濃度結果一致性及對臨床診斷的影響。

1 材料和方法

1.1標本來源 收集2019年8月體檢健康成年人(男、女各60例)EDTA-K2抗凝血漿標本120份，標本采集時間為上午8∶00—11∶00，充分離心后保存于-80 ℃，待檢。體檢健康者納入標準：年齡≥18歲；BMI(體質指數)≤35 kg/m2；血壓<140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；肝功能、腎功能、血糖、血脂等生化指標正常，心、肝、脾、腎超聲檢測大致正常(無嚴重病變)；內科常規檢查無異常：肺部呼吸音清晰，心音、心界、心律正常，肝、腎、脾觸診正常，無腹部包塊及壓痛，神經系統未見異常。

1.2調查樣品制備 收集患者經檢測后剩余EDTA-K2抗凝新鮮血漿標本，保存于-80 ℃,待用。腎素和醛固酮調查樣品分別制備，分2批檢測，編號為S1～S5(低、中、高值各1、2、2個)和S6～S10(低、中、高值各2、2、1個)。調查樣品制備過程：室溫解凍患者標本，直接混合或將高低濃度標本混合制備成不同濃度的調查樣品，去除雜質后分裝，每個樣品均0.4 mL(最大檢測用量0.355 mL)，以冷鏈(干冰)配送至各實驗室待檢。調查樣品的均勻性、穩定性經GB/T 28043—2011附錄B方法檢驗，符合要求。

1.3調查樣品檢測方案 CLIA檢測系統包括進口A系統和國產B、C及D系統(以下簡稱A、B、C、D)，其系統及試劑均相配套，檢測項目為直接腎素濃度(direct rennin concentration，DRC)和血漿醛固酮濃度(plasma aldosterone concentration，PAC)。關于DRC，A與C單位為μIU/mL，B單位為pg/mL，pg/mL與μIU/mL在D系統中均有使用，二者間換算公式為1 pg/mL=1.67 μIU/mL(源自其試劑說明書)；關于PAC，單位均為pg/mL。本研究納入39家實驗室參與調查，室溫解凍后檢測樣品(檢測1次)。由于LC-MS/MS檢測醛固酮靈敏度、特異性及重復性俱佳[6-9]，被推薦為檢測醛固酮的“金標準”，因此，進一步采用LC-MS/MS檢測S6～S10醛固酮濃度。LC-MS/MS分析：采用Phenomenex Kinetex C18(50 mm×4.6 mm，2.6 μm)色譜柱進行色譜分離，流動相為0.2%甲酸水和0.2%甲酸甲醇，梯度洗脫；采用三重四極桿質譜儀AB Triple Quad 5500電噴霧電離源負離子模式，多反應監測模式，醛固酮及d7-醛固酮內標離子對分別為359.2/331.2和366.2/338.3，校準品源自Cerilliant(LOT NO.FN02281704)，單位換算：1 pg/mL=0.1 ng/dL=2.77 pmol/L[5]。

1.4調查樣品數據處理 結果按試劑不同分組，分組數據按Dixon檢驗法剔除離群值后計算均值，實驗室間變異系數(CV)及各樣品的實驗室間CV平均值，其中均值結果用于不同化學發光系統間一致性分析。S6～S10醛固酮結果再與LC-MS/MS進行一致性分析。

1.5健康成人標本檢測 健康成年人標本經A與D系統檢測，其檢測結果用于進一步驗證A與D系統間一致性。A系統配套腎素檢測試劑盒(批號：304001A)和醛固酮檢測試劑盒(批號：134603A)；D系統配套腎素檢測試劑盒(批號：2019020100)和醛固酮試劑(批號：2018120100)。檢測系統不精密度分為批內和批間，腎素項目A系統分別為2.52%～4.87%和7.01%～13.03%，D系統分別為0%～6%和0%～10%；醛固酮項目A系統分別為2.1%～4.2%和5.8%～10.5%，D系統分別為0%～8%和0%～10%。

1.6統計學分析 采用MedCalc19.1.3對數據進行分析。分析不同化學發光系統間檢測結果的一致性，采用Passing-Bablok回歸計算斜率、截距及95%置信區間(confidence interval,CI)，采用Bland-Altman圖分析平均絕對偏差與相對偏差，采用Pearson相關分析相關性。采用Wilcoxon符號秩檢驗和Mann-WhitneyU檢驗比較不同分組的健康成年人的檢測結果。非正態分布數據以M(P25，P75)表示，用P2.5～P97.5表示參考區間。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同檢測系統間DRC結果一致性分析 見圖1和表1。在參與實驗室中，檢測S1～S5的實驗室數量為A=4、B=10、C=2、D=1，檢測S6～S10的實驗室數量為A=4、B=10、C=3、D=18。為便于D系統參與統計分析，按公式換算為μIU/mL和pg/mL。A、C、D以及B、D系統間Passing-Bablok回歸顯示，Y≠X，圖1顯示A-D和B-D線性回歸較為接近，Y=X，但B-D間斜率95%CI不包括1。相關性系數(r)為0.901～0.992(P<0.01)。Bland-Altman分析顯示A-D系統間平均偏差較小。實驗室間CV分別為A(1.85%～16.91%，平均7.38%)、B(6.81%～31.60%，平均15.14%)、C(1.57%～22.61%，平均9.10%)、D(5.54%～8.94%，平均7.44%)，其中在低濃度值樣品中，A、B、D系統CV值較其他濃度值樣品偏高，而C系統絕大多數樣品結果高于A及D系統。B系統結果通過與D系統比較，推測可能與A系統結果偏差較小，而偏低于C系統結果。

注：A、B、C、D分別為A-C、A-D、D-C、B-D之間的Passing-Bablok回歸及相關性分析，黑色實線為Passing-Bablok回歸線，兩側黑色虛線為95%CI線，紅色虛線為Y=X線；r為相關系數。D系統單位換算公式為1 pg/mL=1.67 μIU/mL(源自試劑說明書)。

表1 不同檢測系統間DRC一致性分析結果

2.2不同化學發光系統間PAC結果一致性分析 見圖2和表2。在參與實驗室中，檢測S1～S5的實驗室數量為A=4、B=10、C=7、D=1；檢測S6～S10的實驗室數量為A=4、B=10、C=7、D=18，其中B系統的S5樣品檢出1個離群值。A、B、C及D系統間Passing-Bablok回歸顯示Y均不直接等于X，圖1顯示A-D和B-C線性回歸較為接近Y=X。不同化學發光系統間r為0.944～0.976(P<0.01)。Bland-Altman分析顯示A-D系統間平均偏差最小。各系統實驗室間CV分別為：A(1.98%～11.3%，平均6.66%)、B(11.65%～25.62%，平均17.58%)、C(5.80%～28.32%，平均12.98%)、D(5.16%～8.77%，平均6.61%)。

注：A、B、C、D、E、F分別為A-B、A-C、A-D、B-C、B-D、C-D之間Passing-Bablok回歸及相關性分析，黑色實線為Passing-Bablok回歸線，兩側黑色虛線為95%CI線，紅色虛線為Y=X線。

表2 不同檢測系統間PAC一致性分析結果

2.3PAC結果與LC-MS/MS一致性分析 表3顯示，在Passing-Bablok回歸分析中，Y≠X。在相關性分析中，LC-MS/MS與不同檢測系統PAC結果不具相關性。在Bland-Altman分析中，各系統PAC結果與LC-MS/MS均呈負偏差且偏差較大。

表3 LC-MS/MS與不同檢測系統PAC結果的一致性分析

2.4A和D系統健康成年人DRC和PAC比較分析 A及D系統檢測健康成年人結果的DRC、PAC和ARR中位值均不一致，差異有統計學意義(P<0.05)；不同性別間DRC差異無統計學意義(P>0.05)，而PAC和ARR差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 A、D系統健康成年人結果[M(P25，P75)]

DRC和PAC A、D系統間r分別為0.962和0.944(P<0.01)，DRC和PAC A、D系統的Passing-Bablok回歸分析結果顯示，Y=0.989(95%CI:0.397～1.436)+1.157(95%CI:1.109～1.206)×X，Y=-19.91(95%CI:-27.3244～-13.3446)+1.052(95%CI:0.982～1.123)×X，見圖3，其中，Y為D系統檢測結果，X為A系統檢測結果。

注：A、C為A與D系統健康成年人Passing-Bablok回歸分析；黑色實線為Passing-Bablok回歸線，兩側黑色虛線為95%CI，紅色虛線為Y=X。B、D分別為A與D系統健康成年人的Bland-Altman分析比對絕對偏差圖，中間黑色實線為平均絕對偏差，上下黑色虛線為±1.96s，紅色虛線為0線,其中95%的點均在±1.96s線內。

DRC、PAC立位結果呈偏態分布，以P2.5～P97.5建立參考區間：A系統分別為1.95～68.27 μIU/mL和28.55～313.75 pg/mL；D系統分別為3.53～94.82 μIU/mL和14.5～311.05 pg/mL。

3 討論

本研究結果顯示A與D系統間一致性和相關性均較好，但健康成年人DRC結果兩系統間卻存在恒定差異。以P2.5～P97.5建立DRC和PAC立位參考區間，A系統為1.95～68.27 μIU/mL和28.55～313.75 pg/mL，D系統為3.53～94.82 μIU/mL和14.5～311.05 pg/mL。

目前，DRC和PAC是原發性和繼發性高血壓的分型診斷、治療及研究的重要指標[3]。尤其是在PA的診療活動中，指南推薦醛固酮/腎素比值(aldosterone to rennin ration，ARR)作為篩查指標，在PA確診試驗中以PAC結果為確診依據之一[4-5]。盡管指南也建議實驗室應建立適合自己的相關診斷切點，但通過我們調查發現大多實驗室樂意接受指南或共識所推薦切點，而通過結果分析可以推測同一患者在使用同一診斷切點的情況下，經不同檢測系統檢測可能得出截然不同的診斷結果。

4個系統DRC均采用捕獲抗體加檢測抗體的雙位點檢測活性腎素(包括活性腎素和開放構象腎素原)[10]，因而特異性抗體識別位點的差異可能導致C系統結果偏高及各系統間一致性差異。醛固酮分子量小且結構簡單，PAC采用競爭法檢測，存在與醛固酮3C葡萄糖苷酸(醛固酮代謝產物)及其他類固醇物質發生交叉反應的可能[7]。LC-MS/MS僅檢測純醛固酮，不與其他物質反應，相較于化學發光法，具有更高的靈敏度、特異性及重復性[6-9]，被推薦為檢測醛固酮的“金標準”。在與LC-MS/MS進一步比較中，其結果均高于LC-MS/MS結果(與Yin等[8]研究結果相一致)，其偏差大小與PAC一致性分析中結果相似(A-D、B-C間一致性及相關性較好)。總之，不同檢測系統間的結果準確性及一致性亟待提高。

A與D系統間相關性和一致性均相對較好，而對健康成年人檢測結果進一步驗證分析中，顯示僅PAC結果一致性較好，而DRC結果卻存在一定的恒定誤差，建立參考區間也有所差異，且與楊秀勇等[11]使用類似檢測系統(納入143名健康成人，其中男48名、女9名5)建立的參考區間也不完全一致(DRC和PAC在A與D系統中分別為：2.4～90.0 μIU/mL和30.8～344.6 pg/mL、3.6～98.3 μIU/mL和29.4～473.3 pg/mL)。其原因可能是實驗室間CV，尤其是低濃度值樣品的CV相對更高，且該研究中男女比例不一致可能會影響參考區間的建立。在高血壓人群中，20%～30%表現為腎素和醛固酮均降低，6%～10%表現為腎素降低而醛固酮升高[12]，因此短期內不同檢測系統間一致性不能改善的情況下，目前各實驗室建立一個合理的參考區間對于這部分人群的疾病診斷及監測十分有必要，而通過檢測技術的不斷提高進而實現標準化和一致化，建立統一的參考區間。

本研究不足之處，如部分檢測系統結果的分組數較少，可能會導致結果有所偏差。健康成人納入人群的人口情況(如未檢測K離子濃度等)未充分調查，以排除隱藏的患病人群，可能造成參考區間有偏差。