聯合運用Triton X-100和多聚甲醛改善血液腫瘤骨髓標本熒光原位雜交檢測質量*

傅薔，謝珊珍，葉常姜，黃慧芳

(1.福建醫科大學附屬協和醫院a.福建省血液病研究所，福建省血液病學重點實驗室，b.中心實驗室，福州350001；2.北京金菩嘉醫療科技有限公司，北京100176)

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術能夠在熒光顯微鏡下直接觀察探針信號，分析DNA序列變化，安全、快速、特異性好、靈敏度較高，被廣泛應用于血液病的診斷分型、鑒別診斷、預后判斷及移植后監測等方面[1]。

有效、清晰的熒光信號是保障FISH檢測質量的關鍵。但在抽吸骨髓液標本的過程中，尤其是白血病與多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者的骨髓液，容易發生不同程度的凝固，導致背景熒光信號雜亂、非特異性熒光信號較強、探針信號微弱或缺失等現象。此外，骨髓標本中過多的纖維絲和細胞間的強粘附性等因素，也可能導致FISH探針信號進入細胞困難，造成FISH檢測失敗。

Triton X-100是一種表面活性劑，可以增強膜表面通透性。多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)是一種廣泛用于免疫組化的固定劑，能保持組織的抗原性和細微結構[2]。本研究嘗試在常規FISH實驗流程中增加聯用Triton X-100和PFA處理標本玻片步驟，以期獲得更加清晰、有效的探針信號，改善間期FISH檢測探針信號質量，提高FISH檢測成功率及陽性信號檢出率。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集2018年在福建醫科大學附屬協和醫院血液科就診的42例血液腫瘤患者的骨髓標本，其中MM 25例，慢性髓細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)8例，骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)6例，急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)2例，急性原始粒細胞白血病部分分化型(acute myeloid leukemia-M2，AML-M2)1例，診斷標準參照《血液學診斷及療效標準》第4版[3]。其中男29名，女13名，年齡9～88歲，中位年齡55.5歲。建立各探針檢測閾值共采用10例健康供者的骨髓標本，男7例，女3例，年齡22～45歲，中位年齡34.5歲。以上所有取樣均獲得患者知情同意，并通過福建醫科大學附屬協和醫院倫理委員會批準(批準文號：2016KY050)。

1.2FISH檢測 所用探針均購自北京金菩嘉公司。取-20 ℃保存的固定后的骨髓單個核細胞懸液，用新鮮固定液(甲醇與冰醋酸按體積比3∶1混合)調至合適濃度滴片，按照試劑盒提供的FISH操作說明書操作，Olympus BX51熒光顯微鏡在4，6-二脒基-苯基吲哚(DAPI)/異硫氰酸熒光素(FITC)/羅丹明(RHOD)三色濾光鏡下觀察雜交信號。

1.3Triton X-100/4% PFA預處理對FISH檢測的改良作用 取-20 ℃保存的固定后的骨髓單個核細胞懸液，用新鮮固定液(甲醇與冰醋酸按體積比3∶1混合)調至合適濃度滴片，用Triton 100-X/4% PFA(4% PFA與0.5%Triton X-100按體積比1∶1混合)預處理1 min，吸干液體后置37 ℃預溫的2×檸檬酸鈉鹽(SSC)溶液中溫浴10 min。后續實驗步驟同1.2。

1.4MM骨髓標本熒光免疫表型結合間期原位雜交技術(fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasms, FICTION)檢測 肝素鈉抗凝骨髓液充分裂解紅細胞后，用-20 ℃預冷甲醇預固定，調至合適濃度滴片，Triton X-100/4% PFA固定標本玻片10 min，后續實驗步驟同1.2。翌日雜交結束后，先后用小鼠抗人CD138抗體(一抗)和AMCA標記的山羊抗小鼠IgH抗體(二抗)(以上抗體均購自美國Pepro Tech公司)室溫避光溫育1 h。充分洗滌后加DAPI復染，Olympus BX51熒光顯微鏡在AQUA/FITC/RHOD三色濾光鏡下觀察信號。每份標本分析100個胞漿染為藍色的漿細胞，不計數重疊細胞。結果判讀和閾值建立同1.2。

1.5統計學分析 用SPSS 25.0軟件進行。計量資料的組間比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Triton X-100/4% PFA預處理后的FISH探針信號更清晰 對照組FISH檢測雜交區域非特異性信號雜亂，背景熒光強，探針內信號較小，易受背景及非特異性熒光信號干擾，結果判讀困難。經Triton X-100/4% PFA處理后，雜交區域非特異性熒光信號減少，背景干凈，細胞核內探針信號更清晰，以FITC標記的綠色熒光信號改善效果顯著，見圖1。

注：A，對照組，背景熒光雜亂，探針信號小；B，實驗組，背景干凈，探針信號清晰。

2.2Triton X-100/4% PFA預處理標本玻片能夠提高FISH檢測成功率 42例標本中共檢測148個探針位點，對照組有11個位點因雜交信號細弱、非特異性熒光信號雜亂干擾無法分析，有的甚至細胞核內無雜交信號，導致FISH檢測失敗，檢測失敗率為7.43%(11/148)；Triton X-100/4% PFA預處理的實驗組，FISH檢測成功率達100%(148/148)。

剔除雜交失敗的11個位點后，對有雜交信號的137個檢測位點，分別分析200個細胞核中的信號，實驗組中未見雜交信號的細胞比例為(4.30±3.30)%，對照組為(8.04±5.45)%，二者配對差值(實驗組-對照組)為(-3.74±4.27)%，實驗組未見雜交信號的細胞比例低于對照組(P<0.001)。

2.3Triton X-100/4% PFA預處理標本玻片使FISH檢測結果更準確 在137個檢測位點中，實驗組與對照組的判讀結果一致的有132個位點，其中實驗組的陽性細胞比例為(82.16±23.89)%，對照組為(77.10±23.56)%，二者配對差值(實驗組-對照組)為(5.06±10.08)%，實驗組陽性細胞比例高于對照組(P<0.001)。

此外，有5個檢測位點，實驗組與對照組的判讀結果不一致，見表1。除3號標本來自MDS患者外，其余均來自MM患者。為明確哪組結果更接近真實情況，4份MM標本均采用FICTION進行驗證，FICTION檢測的判讀結果均與實驗組一致，圖2展示了25號標本的FICTION檢測信號。3號標本經擴大計數范圍至500個細胞后，對照組陽性細胞比例為3.0%，最終判定為陰性，與實驗組一致。

表1 實驗組與對照組判讀結果不一致的5個檢測位點

注：箭頭所指均為漿細胞，探針為GLP IgH(斷裂重組探針)

3 討論

作為常規染色體核型檢查的重要補充，間期FISH檢測在血液腫瘤診療中應用廣泛。FISH檢測時，由于在激發光照射下，標本背景成分中的核蛋白、胞質蛋白、膠原纖維等均可產生熒光，容易形成非特異性背景熒光[4]。背景熒光強，判讀信號熒光易受干擾；背景熒光弱，則信號熒光清晰，易于準確判讀。因此，FISH檢測時，除了要保證雜交成功，還應注意減弱背景熒光，增強信號熒光，即提高信噪比。

血液腫瘤細胞中往往含有較多的胞核蛋白和/或胞漿蛋白，干擾了探針與基因組DNA結合，致使探針信號不穩定[5]，最終可能造成間期FISH檢測失敗。另外，我們在臨床工作中也發現，某些標本出現細胞核輪廓不清晰或空洞、背景熒光信號雜亂、非特異性熒光信號強以及探針信號拉絲現象嚴重、信號細弱甚至缺如等現象，導致人工閱片過程費時費力，判讀結果誤差大，遇到復雜信號模式時，極易受到非特異熒光信號的干擾而造成誤判。這種情況與石蠟組織標本FISH檢測中蛋白酶消化不完全時表現相似。

骨髓標本間期FISH常規操作流程中，沒有消化步驟[6]，且骨髓標本與石蠟組織標本不同，蛋白酶消化時間難以掌握。因此，我們嘗試聯合非離子化學表面活性劑Triton X-100和交聯固定劑PFA進行雜交前預處理。Triton X-100對疏水分子具有很高的結合親和力，能夠溶解磷脂膜，從而允許探針進入細胞核[7-8]。PFA是核酸最有效的固定劑，且沒有自發熒光[9]。PFA在固定細胞膜和細胞內蛋白的同時，能夠在一定程度上提高細胞膜的通透性，并可能與Triton X-100呈現協同作用[10]。有報道稱，運用Triton X-100和4% PFA作為固定/滲透化合物能夠增強肽核酸-熒光原位雜交的熒光信號強度[8]。

本研究發現，與常規流程FISH檢測相比，經Triton X-100/4% PFA處理后，熒光顯微鏡下標本的非特異性熒光干擾顯著減少，探針信號拉絲現象減少，信號點更清晰，尤以FITC標記的綠色信號效果顯著。同時，經Triton X-100/4% PFA處理的標本，預處理時間從原來的30 min縮短至10 min，且未見到雜交信號的細胞比例明顯降低，陽性細胞比例也顯著提高。這不僅有效地縮短了實驗操作時間，提高工作效率，而且使FISH檢測成功率提高至100%，有效地降低了判讀復雜、異常時的個人主觀差異，使實驗結果更加客觀可靠。對實驗組與對照組判定結果不一致的4例MM標本，我們進一步采用FICTION檢測方法進行驗證，發現4例標本的判讀結果均與實驗組一致。1例實驗組與對照組結果不一致的MDS標本，經擴大計數范圍至500個細胞后，最終判為陰性，該結果與實驗組一致。

綜上所述，通過在雜交前對標本玻片進行Triton X-100/4% PFA預處理，能夠提高骨髓標本間期FISH檢測成功率和陽性位點檢出率。因此，在骨髓標本FISH檢測時，檢驗人員可以根據疾病種類、標本狀態和具體實驗條件，酌情增加Triton X-100/4% PFA處理步驟，以期獲得更加清晰的探針熒光信號。