希特林蛋白缺乏癥實時熒光PCR解鏈曲線快速基因分型的建立與應用*

劉海平，秦佳純，袁偉曦，黃偉倫，周萬軍

(1.佛山市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，廣東佛山528000；2.南方醫科大學基礎醫學院醫學遺傳學教研室，廣州 510515)

希特林蛋白缺乏癥(Citrin deficiency)是SLC25A13基因突變引起肝細胞線粒體希特林蛋白(Citrin)功能不足，機體代謝紊亂的常染色體隱性遺傳病，主要表現為新生兒肝內膽汁淤積癥(NICCD，OMIM#605814)和成年發作瓜氨酸血癥Ⅱ型(CTLN2，OMIM#603471)2種年齡依賴性表型[1-5]。在目前的臨床實踐中，具有膽汁淤積性黃疸及相應生化指標異常，或新生兒血樣瓜氨酸水平升高的可疑患兒，通過基因檢測以確診是否為希特林蛋白缺乏癥，從而及時采取有效的臨床干預，以改善患兒的生存質量。本研究即以中國人群中SLC25A13基因3種常見突變c.851-854delGTAT、c.1638-1660dup23、IVS6+5G>A為靶點[5-7]，采用特異性探針實時熒光PCR解鏈曲線分析技術策略，建立了一種希特林蛋白缺乏癥快速基因分型方法，報道如下。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 Slan-96S實時熒光定量PCR儀(上海宏石醫療公司)；dNTPs、High Affinity HotStart Taq酶及配套PCR緩沖液等購自北京天根生化科技公司：PCR產物純化試劑盒及全血基因組DNA提取試劑盒(柱提法)均購自德國Qiagen公司。

1.2樣本來源 從南方醫科大學醫學遺傳學教研室樣本資源庫中，隨機選取1例正常個體基因組DNA(gDNA)樣本，以此樣本為基礎，采用定點誘變技術[8-9]分別構建SLC25A13基因c.851-854delGTAT、c.1638-1660dup23、IVS6+5G>A突變質粒DNA，用于方法學研發及檢測體系優化。從佛山市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心收集新生兒篩查干血斑40例，均為2017—2019年樣本，其中正?；蛐?0例、c.851-854delGTAT突變純合子3例、c.851-854delGTAT突變雜合子2例、c.1638-1660dup23突變雜合子2例、c.851-854delGTAT/c.1638-1660dup23突變雙重雜合子1例、IVS6+5G>A突變雜合子2例。干血斑樣本用DNA 提取試劑盒按說明書提取gDNA以備用。所有SLC25A13基因突變陽性樣本均經Sanger測序確診，且患兒或其家屬均已簽署知情同意書，用于方法學的應用與評價。

1.3技術策略及引物探針設計 參照本課題組的實時熒光PCR解鏈曲線基因突變檢測通用技術方案及技術發明專利[10-11]，根據SLC25A13基因(NC_000007.14)DNA序列中c.851-854delGTAT、c.1638-1660dup23、IVS6+5G>A突變位點所在位置，分別設計相應的PCR擴增引物、熒光標記及對應淬滅探針。其中，針對2種突變類型分別采用不同的熒光標記探針設計方案：針對c.851-854delGTAT、IVS6+5G>A等In/Del或點突變類型，以突變位點野生型或突變型的互補DNA序列為探針，利用探針與野生型和突變型的雜交/解鏈溫度差異而實現檢測目標；針對c.1638-1660dup23等片段插入或缺失突變類型，則分別設計Tm值不同的野生型和突變型探針。PCR擴增引物及熒光/淬滅探針見表1，均由上海生工生物公司合成。

表1 各SLC25A13基因突變位點的PCR擴增引物及熒光/淬滅探針

1.4多重PCR熒光探針解鏈曲線檢測體系的建立 反應體系總體積為25.0 μL，含10×HA buffer(15 mmol/L MgCl2)2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL、5.0 U/μL High Affinity HotStart Taq酶0.3 μL、5.0～20.0 ng gDNA模板或10.0～20.0 pg質粒DNA 1.0 μL、10.0 μmol/L上、下游引物各0.5 μL、10.0 μmol/L熒光標記/淬滅探針各0.1 μL，ddH2O補足體積。于Slan-96P 實時熒光PCR儀，以儀器配套軟件，設置反應條件與參數為：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共35個循環，72 ℃再延伸10 min，95 ℃變性5 min，40 ℃雜交10 min，42～70 ℃解鏈分析采集熒光信號。

1.5基因分型結果判讀及方法學評價 以各突變位點野生型和突變型質粒DNA為樣本，用已建立的反應體系進行檢測，據各樣本的解鏈曲線結果圖，確定各突變位點野生型和突變型的解鏈曲線Tm值。分析受檢樣本時，根據各突變位點的解鏈曲線Tm值結果而判定基因型(圖1)：如3個突變位點均只有野生型Tm值解鏈峰結果，為排除這3個位點突變的正常樣本；如其中某突變位點只有突變型Tm值解鏈峰結果，基因型為此位點突變型純合子；如其中某突變位點有野生型和突變型Tm值解鏈峰結果，基因型為此位點突變雜合子；如結果顯示有2個位點的突變雜合，基因型即為此2個位點的突變雙重雜合子。

將已收集的40例已知基因型血斑標本gDNA，盲法編號后用所建立的方法進行分析，判斷本方法所檢測的基因型結果與已知的基因型結果進行相符率計算，評價所建立方法的敏感性與特異性。

2 結果

2.1希特林蛋白缺乏癥實時熒光PCR解鏈曲線快速基因分型方法評價 建立的實時熒光PCR解鏈曲線快速基因分型方法能對人類希特林蛋白缺乏癥SLC25A13基因c.851-854delGTAT、IVS6+5G>A和c.1638-1660dup23位點的野生型和突變型進行準確檢測，實現希特林蛋白缺乏癥的快速基因分型，基因型的解鏈曲線結果見圖1。

注：藍色為FAM熒光通道，檢測突變位點為c.851-854delGTAT，野生型和突變型的解鏈Tm值分別為(62.0±0.5)℃和(57.0±0.5)℃;綠色為HEX熒光通道，檢測突變位點為c.1638-1660dup23，野生型和突變型的解鏈Tm值分別為(52.0±0.5)℃和(57.0±0.5)℃;黃色為ROX熒光通道，檢測突變位點為IVS6+5G>A，野生型和突變型的解鏈Tm值分別為(62.5±0.5)℃和(58.5±0.5)℃;A,正常樣本;B,c.851-854delGTAT突變純合子；C,c.1638-1660dup23突變雜合子；D,IVS6+5G>A突變雜合子。

2.2臨床樣本檢測及方法學評價 40例已知基因型干血斑gDNA樣本，盲法編號后采用本方法檢測，各樣本的基因型結果均與已知基因型相符，結果顯示此方法的敏感性與特異性均達100%。

3 討論

希特林蛋白缺乏癥是一種遺傳代謝病，中國人群的基因突變攜帶率高達1/63[12-14]。此病臨床表現復雜，癥狀無特異性，早發現、早確診、早干預，對提高患兒生活質量、提高人口素質和健康水平具有重要意義。在目前希特林蛋白缺乏癥診斷的臨床實踐中，主要是根據患者的臨床癥狀和生化指標(兒童或成人)，或新生兒篩查異常指標，通過目的基因PCR擴增及DNA測序進行基因診斷[15-18]。希特林蛋白缺乏癥SLC25A13基因序列長、突變位點分散，此傳統技術策略只能對各個突變位點分別進行PCR擴增和DNA測序，操作繁瑣、耗時長、成本高。近年來，隨著遺傳代謝病研究的深入及新生兒疾病篩查的普及，對希特林蛋白缺乏癥的認識及重視程度也逐年提高，簡單實用、準確可靠的基因診斷方法，也正是當前希特林蛋白缺乏癥常規基因診斷及人群分子篩查的現實所需。

相關報道顯示，SLC25A13基因突變譜以高頻突變為主，我國人群中，c.851-854delGTAT、c.1638-1660dup23最常見，IVS6+5G>A次之[5,14,19-22]。本研究即以此3種高頻突變為靶點，采用三重實時熒光PCR解鏈曲線技術，建立了一種希特林蛋白缺乏癥靶基因位點快速基因分型方法。應用及評價結果顯示，本方法的解鏈曲線結果圖直觀而易于判讀，且為一次性閉管操作，簡單實用、準確穩定、低成本自動化，可作為當前希特林蛋白缺乏癥SLC25A13基因常規分子診斷及人群分子篩查的適用方法。也必須強調的是，本方法是針對希特林蛋白缺乏癥SLC25A13基因3種中國人群突變熱點的快速基因分型；此范圍之外的其他突變位點或突變類型，須采用其他技術方法進一步檢測分析，也可根據本研究采用的通用技術策略而構建相應突變位點的快速檢測方法。