GeneXpert實時熒光定量PCR在診斷艱難梭菌感染中的臨床應用*

程敬偉，劉暢，肖盟，孫宏莉，王瑤，楊啟文，徐英春

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院檢驗科，北京 100050；2.清華大學附屬華信醫院檢驗科，北京 100016；3.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，北京100730)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種產芽胞革蘭陽性厭氧菌。大量應用廣譜抗生素、免疫抑制劑或化療藥物可導致腸道菌群失調，艱難梭菌優勢繁殖并分泌毒素而引發艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)[1]。臨床上，約10%～25%的抗生素相關性腹瀉及90%以上的偽膜性腸炎由CDI引起[2]。近年來，一種高毒力核糖體型別027型(RT027)艱難梭菌在歐美等國家大規模暴發流行，該菌株感染引起的發病率、復發率及死亡率更高[3]。目前，RT027型菌株已在我國的北京、廣州、武漢、香港和臺灣等地區分離報道[4-6]。CDI主要的診斷方法包括傳統的厭氧培養法、基于酶免疫反應的谷氨酸脫氫酶(GDH)和毒素A/B檢測，以及核酸擴增技術(nucleic acid amplification tests, NAATs)檢測毒素基因等，各方法的敏感性、特異性存在一定差異。GeneXpert艱難梭菌核酸檢測試劑盒基于實時熒光多重PCR技術，可同時檢測毒素B基因、二元毒素基因以及tcdC基因117位的缺失(報告是否為RT027型菌株)。本研究旨在評價GeneXpert試驗診斷CDI的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1標本來源 收集2016年1月至2017年6月北京協和醫院住院腹瀉患者非重復糞便標本296份?；颊吣挲g2～95歲，中位年齡58歲；男性患者占51%；內科患者占58%，外科患者占15%，其他科室患者占27%。

1.2主要儀器和試劑 GeneXpert系統及配套的艱難梭菌檢測試劑盒(美國Cepheid公司)，S100 Thermal Cycle PCR擴增儀(美國伯樂公司)，毛細管電泳用ABI 3730測序儀(美國應用生物系統公司)，艱難梭菌鑒定培養基(CDIF)、哥倫比亞血瓊脂培養基、厭氧產氣袋(法國生物梅里埃公司)，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)儀(德國Bruker Doltanics公司)。

1.3GeneXpert試驗 用拭子取少量不成形糞便，拭子在樣本處理試劑中混懸，將樣品管中所有液體移入檢測盒的樣品室，將檢測盒載入GeneXpert全自動醫用PCR分析系統中，根據產品說明書進行操作和結果判讀。報告：僅有內參基因陽性為產毒艱難梭菌陰性；內參基因陽性及tcdB基因陽性為產毒素B艱難梭菌；內參基因陽性、tcdB基因陽性、tcdC基因陽性且二元毒素基因陽性，報告為核糖體型別027型菌株。

1.4產毒素培養(toxigenic culture, TC) TC指糞便培養分離艱難梭菌，再用PCR方法檢測菌株是否含有毒素基因。TC陽性：培養分離出艱難梭菌，且檢測到毒素基因；TC陰性：未分離出艱難梭菌，或分離到艱難梭菌但未檢測到毒素基因。

1.4.1艱難梭菌培養及鑒定 取不成形糞便標本直接接種于CDIF培養基，置于厭氧產氣袋37 ℃培養48 h，將具有黑色菌落特征的菌株轉種至哥倫比亞血瓊脂培養基，厭氧培養48 h后取單菌落進行MALDI-TOF MS質譜鑒定。將單菌落均勻涂布于質譜靶板上，滴加1 μL HCCA肉桂酸基質，待干燥后參照儀器說明書上機檢測。

1.4.2艱難梭菌毒素基因檢測 使用五重PCR的方法擴增艱難梭菌的16S rDNA、毒素A、B編碼基因tcdA、tcdB以及二元毒素基因cdtA、cdtB，并對tcdA基因是否存在1.8 kb片段缺失進行確證[7-8]。引物見表1。

1.5PCR-核糖體分型 PCR擴增艱難梭菌核糖體DNA基因間隔區(rDNA intergenic spacer region, ISR)，其中16S-USA端引物使用5′-FAM進行熒光標記，在ABI 3730測序儀上用毛細管電泳的方法對擴增產物進行檢測，將數據提交至數據庫http://webribo.ages.at并確定菌株核糖體型別[9]，引物見表1。

表1 艱難梭菌毒素基因擴增及分型引物

1.6統計學分析 采用SPSS 22.0軟件，以TC結果為參考，計算GeneXpert試驗的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值，用Kappa檢驗評價結果一致性。

2 結果

2.1TC結果 296份糞便標本中，共培養出艱難梭菌152株，其中tcdA+tcdB+cdtA/cdtB+(A+B+CDT+)型3株、tcdA+tcdB+cdtA/cdtB-(A+B+CDT-)型113株、tcdA-tcdB+cdtA/cdtB-(A-B+CDT-)型18株、不產毒菌株tcdA-tcdB-cdtA/cdtB-(A-B-CDT-)18株。共檢出毒素基因陽性菌株134例。部分菌株五重PCR擴增產物電泳及tcdA基因擴增產物電泳結果見圖1、圖2。

注：1號菌株，tcdA、tcdB、cdtA、cdtB基因陽性；2—6、8—12號菌株，tcdA、tcdB基因陽性；7號菌株，陰性；M，100 bp ladder marker。

注：M，2 000 bp marker；a、b、c、d、e、h、i、j、k,菌株無tcdA缺失；f、g,菌株tcdA缺失。

2.2GeneXpert試驗結果 296份標本中，GeneXpert報告陽性標本144份，陰性標本152份，陽性標本中包括142份產毒素B艱難梭菌，2份RT027型艱難梭菌。

2.3GeneXpert與TC檢測結果的比較 以TC為參考，GeneXpert試驗的敏感性為98.5%，95%置信區間為94.7%～99.8%；特異性為92.6%，95%置信區間為87.4%～96.1%；陽性預測值為91.7%，95%置信區間為85.9%～95.6%；陰性預測值為98.7%，95%置信區間為95.3%～99.8%。2種方法總一致率為95.3%，一致性檢驗Kappa值為0.905，GeneXpert與TC一致性好，見表2。GeneXpert與TC檢測結果不一致的標本有14份，其中GeneXpert陽性、TC陰性標本12份，包括未培養出菌株標本9份，培養出的菌株但不產毒素標本3份；另外2份標本為GeneXpert陰性、TC陽性，菌株分別為A-B+CDT-型和A+B+CDT-型。

表2 GeneXpert試驗與TC檢測結果的比較

2.4GeneXpert與PCR-核糖體分型 GeneXpert試驗報告2株RT027型艱難梭菌；PCR-核糖體分型結果顯示，與RT027型標準菌株條帶一致，確證為RT027型艱難梭菌。RT027型艱難梭菌與標準菌株的毛細管電泳圖譜見圖3。

注：A、B，臨床菌株圖譜；C，CA2標準菌株圖譜；橫軸為ISR片段長度；縱軸為峰強度。

3 討論

CDI的診斷主要包括腹瀉患者糞便標本中檢測到艱難梭菌毒素或者產毒素的艱難梭菌，或者內鏡檢查為偽膜性腸炎[10]。艱難梭菌培養以及GDH檢測具有較高的敏感性，不能區分菌株是否產毒素，而直接從糞便標本中檢測毒素A/B的酶免疫方法敏感性較低，不推薦單獨用于診斷CDI[11-12]。CDI診斷的金標準包括細胞毒性中和試驗和TC，但2種方法操作繁瑣，不適應于臨床常規使用。GeneXpert試驗可直接從糞便標本中快速檢測毒素基因，在國外已得到廣泛應用。

本研究結果表明，GeneXpert試驗的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值均在90%以上。這與上海華山醫院黃海輝教授牽頭的多中心研究結果較為接近[13]，文獻綜述表明GeneXpert試驗的敏感性為94%～100%、特異性為93%～99%[12]。GeneXpert試驗操作簡便，且可在1 h內發出報告，具有良好的臨床應用價值。此外，GeneXpert可準確報告高毒力RT027型艱難梭菌，對流行病學調查和院內感染防控均有重要意義。RT027型高毒力艱難梭菌在歐美等地區引起大規模暴發流行。近年來，我國多個城市報道了散發的RT027型菌株，與歐美等不同的是，我國ST37和ST81型A-B+型艱難梭菌流行率較高，該型菌株同樣可以引起臨床患者重癥感染。GeneXpert檢測的靶標為tcdB基因、二元毒素基因以及tcdC基因，本研究結果表明A-B+型菌株同樣可被GeneXpert準確報告為陽性標本，目前國內尚未發現A+B-型艱難梭菌。

本研究中所用五重PCR檢測艱難梭菌毒素基因為傳統的PCR方法，之后使用電泳技術檢測是否擴增出毒素基因，該方法操作復雜，在常規臨床實驗室不易開展。PCR-核糖體分型技術常用于艱難梭菌的流行病學調查，PCR擴增后使用毛細管電泳技術檢測艱難梭菌ISR多態性，然后與標準菌株比對確定其核糖體型別。該技術因缺乏標準化而難以推廣和應用，目前更常用的分型方法為多位點序列分型技術。NAATs直接檢測艱難梭菌毒素基因，具有較高的敏感性，被美國胃腸病學會和美國感染病學會推薦可作為唯一的獨立測試技術診斷CDI[11,14]。歐洲臨床微生物與感染病學會和中國艱難梭菌感染診斷和治療專家共識推薦使用兩步法或者三步法聯合診斷CDI，NAATs則作為其中的重要一個步驟[10,15]。一些研究者擔憂NAATs方法過于敏感而導致過度診斷和治療[16]。臨床應結合患者是否具有高危因素及其他實驗室檢查綜合判斷CDI或定植。

綜上所述，GeneXpert 實時熒光定量PCR方法具有較高的敏感性和特異性，可為CDI的診治提供可靠的科學依據。