環介導等溫擴增技術在下呼吸道感染常見病原體檢測中的應用*

顧錦，郭會，周圍，吳玉敏，毛易捷，孫靖，馬錦洪，王玉月，史偉峰

(蘇州大學附屬第三醫院檢驗科，江蘇常州 213003)

據世界衛生組織發布的最新統計結果顯示, 2016年下呼吸道感染造成全世界300萬人死亡，其導致的嚴重疾病已經成為全球關注的公共衛生問題[1]。傳統的細菌培養和細菌學檢驗技術不能及時準確地為臨床提供診斷結果，這是造成下呼吸道感染疾病致死率居高不下的主要原因之一。因此，建立一種高效、敏感、快速、準確的病原學檢測方法, 對臨床早期診斷和精準治療有著至關重要的作用。環介導等溫擴增技術(loop-mediated thermostatic amplification, LAMP)針對靶基因的6個區域設計4條特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫(65 ℃)條件下反應[2]，用熒光染料摻入法進行實時熒光檢測，擴增陽性的樣品可產生類似實時熒光的“S”形擴增曲線，一步完成對靶基因的擴增和檢測。同時將LAMP法與微流體芯片技術相結合，可同時對多種病原體核酸靶序列進行高通量并行檢測[3]。該技術不需要經過模板的高溫變性和低溫退火過程，在1 h內即可完成檢測，大大縮短了檢測周期[4]。本研究使用傳統培養法加基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)鑒定和LAMP法對148例下呼吸道感染患者標本同時檢測，LAMP法檢出的肺炎支原體標本再采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR，RT-qPCR)法復檢，而結核分枝桿菌復合群檢出后使用二代測序(next-generation sequencing technology，NGS)技術驗證，以期為臨床提供更為快速可靠的實驗室診斷依據。

1 材料和方法

1.1一般資料 選取2018年6月到2019年10月在蘇州大學附屬第三醫院呼吸內科就診的下呼吸道感染患者合格的痰標本103例，男性78例，女性25例，年齡(65.7±17.0)歲。其中，慢性阻塞性肺疾病急性加重患者16例，支氣管擴張急性加重患者7例，慢性支氣管炎急性發作患者10例。選擇同期兒科患者45例，年齡0～12歲，留取肺泡灌洗液標本45份。

1.2儀器和試劑 恒溫金屬浴(杭州奧盛科技公司)，恒溫混勻儀(杭州瑞成儀器公司)，MALDI-TOF MS儀(德國布魯克公司)，RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀、H-1微型混合器(上?？岛坦怆妰x器公司)，呼吸道病原體核酸檢測試劑盒(微流控芯片、陽性對照品、恒溫擴增試劑)(北京博奧生物公司)，ABI 7500擴增儀(美國應用生物系統公司)。肺炎支原體核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法，中山大學達安基因公司)，MGISEQ-2000基因測序儀(深圳華大智造公司)。

1.3標本采集及處理 使用無菌有蓋容器取痰液或纖支鏡灌洗液，肉眼觀察痰液性狀后取少量涂片，染色鏡下觀察上皮細胞和白細胞數量，根據觀察結果初步判斷感染情況。

1.4MALDI-TOF MS細菌鑒定 用無菌拭子挑取標本涂布接種于血平板和巧克力平板上培養72 h后觀察結果，嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》進行操作。挑取每份臨床標本常規細菌培養后可疑的單個菌落再次分純培養。將分純后的菌株在MALDI-TOF MS細菌鑒定儀上檢測，以Bruker Biotyper系統線性正性模式采集相對分子質量2 000～20 000的蛋白質指紋圖譜，與標準數據庫進行比對，得出匹配分值用以判斷結果。匹配分值>2.0為鑒定到菌種水平，結果高度可信；分值1.7～2.0為鑒定到菌屬水平，結果可信；分值<1.7為鑒定結果不可信。本研究以1.7分為界值，未達1.7分視為未檢出。

1.5LAMP試驗

1.5.1標本處理及核酸提取 痰標本、肺泡灌洗液中加入等體積10%NaOH，置于漩渦振蕩器上使標本盡可能振散，然后37 ℃液化30 min，黏稠度高的標本可適當增加NaOH量或延長液化時間，液化后的痰標本以沒有黏稠感為宜。取1 mL液化后的痰標本或肺泡灌洗液至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液；向離心管中加入1 mL洗液，渦旋振蕩，12 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入100 μL核酸提取液，用移液器吹吸沉淀，將液體和沉淀一起轉移至核酸提取管中，將核酸提取管置于微型混合器中，最大振速振蕩至少5 min；將核酸提取管置于95 ℃金屬浴中，加熱至少5 min。然后10 000 r/min離心1～3 min，取上清液核酸留作恒溫擴增和RT-qPCR。

1.5.2恒溫擴增反應及結果判斷 將20 μL恒溫擴增反應液和35 μL核酸提取液加入200 μL離心管中，混勻后加至呼吸道病原體核酸檢測芯片中，將芯片置于離心機6 000 r/min離心1 min后上RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀擴增。結果定性標準：45 min內擴增曲線明顯出峰，且半定量結果≥1×103，即判定陽性；標本細菌濃度<1×103或沒有明顯擴增曲線，判定為陰性。

1.6RT-qPCR 選取45例兒科患者肺泡灌洗液標本，用肺炎支原體核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)進行檢測。取肺炎支原體RT-PCR反應液40 μL、Taq酶3 μL、1.5.1處理后的樣本核酸2 μL以及陰性、弱陽性、強陽性質控品各2 μL，混合成45 μL體系進行擴增。按照增長曲線及Ct值進行結果判讀：如果增長曲線不呈S型或Ct值=30，判定為陰性；如果增長曲線呈S曲線，且Ct值<30則判定為陽性。

1.7高通量測序 選擇2份LAMP檢測后結核分枝桿菌復合群陽性的痰標本，委托深圳華大基因公司進行高通量測序。取0.5～3 mL痰標本，經玻璃珠混合震蕩后按照TIANamp Micro DNA Kit(DP316,天根公司)試劑盒說明書提取DNA。提取后的DNA超聲破碎至150 bp大小的片段。核酸片段經過末端修復、接頭連接、無偏向性PCR放大信號后完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫插入片段(大小200～300 bp)，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher公司)質控DNA文庫濃度(不低于1 ng/μL)。質量合格的文庫序列經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫經滾環復制生成DNA納米球。制備好的DNA納米球加載到測序芯片，使用MGISEQ-2000基因測序儀進行測序。測序數據下機后去除低質量的和長度小于35 bp的數據以獲得高質量的數據。通過BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對將高質量數據中比對上人參考基因組序列的數據去除。剩下的數據在去除低復雜度reads后與專用的微生物大數據庫比對，并將比對后的數據按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲等進行分類和排列。專用的微生物大數據庫包括篩選自NCBI數據庫(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)的與人類疾病相關的4 061個病毒基因組、2 473個細菌基因組、199個真菌基因組和135 個寄生蟲基因組。

1.8統計學分析 用SPSS 17.0 統計軟件進行。計數資料以率或構成比表示，配對計數資料比較采用Fisher精確概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1細菌分離培養及質譜鑒定 148例標本中經常規培養后，MALDI-TOF MS鑒定的總檢出率為42.6%(63/148)，共分離出81株病原菌。63例陽性標本中，有44例檢出單一致病菌(29.7%)，19例檢出復合病原菌，其中13例檢出2種病原菌(8.78%)，5例檢出3種病原菌(3.3%)，1例檢出4種病原菌(0.68%)。

2.2LAMP檢測結果 LAMP以細菌拷貝數1×103為界值，148例標本判定為陽性結果的有101例，檢出率為68.2%，共檢測出175種病原體。45例肺泡灌洗液中共檢出肺炎支原體26株(57.8%)。101例陽性標本中，55例(37.2%)為單一病原菌，46例為復合病原菌(31.1%)，其中合并2種病原菌有32例(21.6%)，合并3種病原菌有7例(4.7%)，合并4種病原菌僅3例(2.7%),合并5種病原菌2例(1.3%)，合并6種病原菌1例(0.6%)，合并7種病原體1例(0.6%),見圖1。

注：a，大腸埃希菌；b，肺炎支原體；c，鮑曼不動桿菌；d，陽性外對照；e，流感嗜血桿菌；f，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；g，陽性對照；h，銅綠假單胞菌；i，金黃色葡萄球菌。

2.3LAMP技術與質譜法檢測細菌的比較 當在同一份標本中2種方法檢出至少一種相同的細菌，就判為2種結果相符(雙陽性)，否則認為不符。148份標本中，2種方法檢測到至少同一種細菌有42例(雙陽性)，2種方法均未檢測到細菌39例(雙陰性)，LAMP陽性而痰培養質譜鑒定陰性或檢測出完全不同的病原體59例，質譜法陽性而LAMP陰性8例。2種檢測方法對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌的檢出率差異無統計意義(P>0.05)，而LAMP法對肺炎鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌以及肺炎支原體的檢出率高于培養法(P<0.05)，見表1。

表1 148例患者行LAMP法檢測下呼吸道病原體感染情況

2.4RT-qPCR及NGS檢測結果 148例樣本中，LAMP法檢出肺炎支原體26例，RT-qPCR法檢出23例，兩者一致率達88.5%。見圖2A。另外，148例樣本中LAMP法檢出結核分枝桿菌復合群2例，抗酸染色均未找到分枝桿菌，見圖2B。將2例樣本外送NGS測序，分析證實為結核分枝桿菌復合群陽性。樣本(18S4001600)下機總序列數為38034682條，總數據量約1.9 G，檢出結核分枝桿菌序列數440條，基因組覆蓋率為0.494%(21 929/4 439 387)，相對豐度為18.96%。樣本(19S0031462)下機總序列數為23 636 361條，總數據量約為1.2 G，檢出結核分枝桿菌序列數2條，基因組覆蓋率為0.002 3%(100/4 439 387)，相對豐度為4.44%。

注：A，a，陽性外對照；b，陽性內對照；c，肺炎支原體；B，a，陽性外對照；b，陽性內對照；c，結核分枝桿菌復合群。

3 討論

人體的上呼吸道常有定居細菌群，下呼吸道分泌物經上呼吸道排出時通常受到正常菌群的污染[5]，故本研究檢出的呼吸道定植菌需要結合臨床表現判斷是否存在由該細菌引起的感染。下呼吸道感染包括急慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴張等疾病，主要由細菌、支原體、衣原體、嗜肺軍團菌、病毒等微生物感染引起，常由上呼吸道感染向下蔓延，其反復發作會繼發多器官感染[6]。臨床上供選擇的抗菌藥物日益增多，耐藥菌株亦明顯增多，大劑量頭孢菌素的應用更導致院內感染愈加嚴重。早期診斷可以指導下呼吸道感染的治療選擇針對病原體的有效抗菌藥物。呼吸道標本常規的細菌檢驗路徑為首先肉眼觀察和涂片檢查標本是否合格，將標本接種于血平板、巧克力平板、麥康凱平板培養基，真菌檢查接種于沙氏培養基，結核分枝桿菌檢查則接種于羅-琴培養基或米氏7H10培養基，于35 ℃培養18～24 h觀察菌落形態和涂片染色鏡檢，然后進行質譜鑒定和藥敏試驗。肺炎支原體培養因營養要求高，生長緩慢，需觀察10～30 d或更長時間，對臨床診斷幫助不大，因此抗原/抗體或核酸檢測更為廣泛[7]。

148例疑似下呼吸道感染患者的肺泡灌洗液和痰樣本使用LAMP檢測，結果表明LAMP十三聯檢較傳統培養法病原體檢出率高，因為LAMP法敏感性和特異性較高，能從微量拷貝中擴增出所需的目的基因，其檢測下限為6個拷貝。LAMP法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌陽性由mecA基因指示，結果顯示從103例痰標本中檢測出24例耐甲氧西林葡萄球菌，而常規培養法未檢出。在常規培養中，葡萄球菌的藥敏檢測方法主要有紙片擴散法和肉湯稀釋法，具有檢測速度快、操作簡便、價格低廉、可直觀反應檢測結果等優勢，但是在前期分離培養過程中常常因為其菌落較其他細菌菌落小而被覆蓋，容易造成漏檢，而且菌落表達情況各不相同，導致紙片擴散法檢測存在一定誤差。

肺炎支原體是呼吸道感染中的常見病原體[8]，也是社區獲得性肺炎的主要病因。肺炎支原體由于缺乏細胞壁而對常見的β-內酰胺類抗菌藥物不敏感[9]，早期診斷肺炎支原體感染可以減少這類抗菌藥物的不必要使用。本文采用LAMP法從45例肺泡灌洗液中檢出26例肺炎支原體，而使用RT-qPCR法則檢出23例，兩者一致率為88.5%。RT-qPCR對肺炎支原體的檢測具有高靈敏度和快速性，僅需2～3 h即可獲得結果，但是由于其昂貴的成本和復雜的處理程序以及對專業水平的要求高而無法在基層地區常規推廣，尤其是在基層實驗室。因此，LAMP可以快速簡便地檢測肺炎支原體，有效改善其診斷速度和治療，并減少對抗菌藥物的濫用，且其敏感度并不亞于RT-qPCR法。

由于結核分枝桿菌生長緩慢，難分離培養出菌落，容易耽誤患者診療。本文采用LAMP技術檢測出2例結核分枝桿菌復合群，用高通量測序證實為結核分枝桿菌復合群，提示LAMP法可快速診斷出結核分枝桿菌復合群，比常規培養法敏感性高，且成本較低高通量測序更低。

綜上所述，呼吸道病原體核酸恒溫擴增芯片十三聯檢較傳統細菌培養檢測，具有高效、快速、敏感、簡單及覆蓋面廣的優點，可為臨床診治提供快捷可靠的實驗室依據，對臨床早期診斷和精準治療具有重要作用。