周期素依賴性激酶10 在食管鱗癌中的表達及其臨床意義

冶正財， 游顏杰， 呼圣娟，

（1.寧夏醫科大學附屬自治區人民醫院暨第三臨床學院，銀川 750002； 2.寧夏回族自治區人民醫院消化內科，銀川 750002）

我國是食管鱗狀上皮細胞癌（簡稱食管鱗癌）的高發國家之一，轉移是導致食管鱗癌臨床治療失敗和患者死亡的最主要原因。深入研究食管鱗癌轉移相關分子機制，將為開發臨床診斷的分子標志物、確定臨床治療的藥物靶點以及制訂有效的臨床治療方案提供理論和實驗依據[1]。細胞周期素依賴性激酶10（cyclin-dependent kinase 10，CDK10）是細胞周期蛋白依賴性激酶家族成員[2-4]。研究[2-7]表明，CDK10 受到諸多信號通路的精細調控，可能在不同來源惡性腫瘤進展中發揮不同的功能與作用。本研究應用免疫組織化學法檢測CDK10 蛋白在食管鱗癌組織中的表達狀態，旨在探討其與臨床病理因素和患者生存期的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

食管鱗癌組織石蠟包埋標本組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，包含2007 年7 月—2010 年12 月手術切除并經病理確診的208 例原發食管鱗癌組織，樣本來源于上海市腫瘤疾病研究所。依據國際抗癌聯盟（International Union Against Cancer）TNM 分期：Ⅰ期20 例，Ⅱ期83 例，Ⅲ期70 例，Ⅵ期25 例（10 例缺失）；病理分級：Ⅰ期34 例，Ⅱ期135 例，Ⅲ期39 例。患者術前未接受任何放化療和生物治療。對于所有患者資料進行電話生存隨訪截止到2017 年7 月，其中死亡患者149 例。

1.2 主要試劑

兔抗人CDK10 多克隆抗體購自Abcam 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記通用性EnVision試劑盒購自上海長島生物技術有限公司，DAB 試劑購自中山金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色

石蠟包埋標本經4 μm 厚度切片，0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液抗原熱修復。按EnVision 二步法說明書進行染色，CDK10 抗體工作濃度為1∶200，DAB 顯色，蘇木素對比染色，透明封固，PBS 代替一抗作為空白對照。

1.4 結果判定

CDK10 表達狀態判定標準[5]：以細胞核出現明顯的黃色至棕黃色顆粒為陽性細胞信號。采用2 個參數（即染色強度和陽性細胞數）記分乘積的半定量計分方法。著色強度記分標準：無著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。隨機選取10 個高倍視野（×400）計數腫瘤細胞的陽性百分率，記分標準：無染色為0 分，1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。染色強度記分與陽性細胞數記分之積為最后得分，＜3 分為低表達，≥3分為高表達。

1.5 統計學方法

數據采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析。計數資料比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法和Log-rank 檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床病理參數的食管鱗癌組織中CDK10表達比較

食管鱗癌組織中CDK10 蛋白主要表達于腫瘤細胞的細胞核（圖1）。208 例臨床樣本中，54例呈低表達（26.0 %），154 例呈高表達（74.0 %）。食管鱗癌組織中CDK10 表達在臨床TNM 分期III/IV 期高于I/II 期，淋巴結轉移組（N1～N3）高于無淋巴結轉移組（N0），T3/T4 組高于T1/T2 組，男性患者組高于女性患者組（P 均＜0.05）。不同年齡、組織學分級、P53 和Ki67 表達狀態下，CDK10 表達差異無統計學意義（P 均＞0.05）。見表1。

圖1 食管鱗癌組織中CDK10 的表達（EnVision ×200）

2.2 CDK10 表達與食管鱗癌預后參數的關系

Kaplan-Meier 法分析食管鱗癌組織中CDK10表達與患者總生存期之間的關系。食管鱗癌組織中CDK10 高表達的患者［中位生存時間為（31.3±2.7）個月］總生存期低于CDK10 低表達的患者［中位生存時間為（69.5±63.1）個月）］（P＜0.001）。見圖2。

3 討論

選擇特異性的腫瘤分子標志物，并以此建立靈敏高效的檢測方法成為乳腺癌轉移臨床診斷、預后評估與指導合理用藥的迫切要求。已有研究[6-7]表明在雌激素受體（estrogen receptor，ER）存在的情況下，CDK10 表達缺失增強乳腺癌細胞對選擇性雌激素受體調節劑他莫西芬的藥物抵抗性。在肝癌和膽管癌中的研究[2，8]發現，CDK10在多種惡性腫瘤組織和腫瘤細胞系中表達下調或缺失。此外，相關研究[9]證實乳腺癌中CDK10同C1orf63 二者呈正相關關系，而C1orf63 是一種參與細胞周期退出的細胞靜態控制基因（cellular quiescence-controlling gene），二者表達呈現正相關。功能試驗證實miR-3127-5p 可通過抑制CDK10 表達促進肝癌細胞遷移與侵襲[10]。近期在乳腺癌和卵巢癌中的研究[11-12]證實，啟動子高頻甲基化可能是造成CDK10 基因失活的重要原因之一。上述既往研究表明CDK10 在多種惡性腫瘤組織中表達下調或缺失，可能是新的候選抑癌基因，然而對于CDK10 基因表達在食管鱗癌中的研究目前未有相關報道。

表1 不同臨床病理參數的食管鱗癌組織中CDK10 表達比較

圖2 食管鱗癌組織中不同CDK10 表達患者生存曲線的比較

本研究發現食管鱗癌組織中CDK10 表達在臨床TNM 分期III/IV 期高于I/II 期，淋巴結轉移組（N1～N3）高于無淋巴結轉移組（N0），T3/T4 組高于T1/T2 組，男性患者組高于女性患者組。據此推測CDK10 高表達可能是促進食管鱗癌發展的重要分子事件。結合患者預后資料進一步統計分析發現，CDK10 高表達患者總生存期低于低表達者。上述結果提示在食管鱗癌進展中CDK10可能發揮類似于癌基因的作用，這有別于以往在其他類型腫瘤中研究發現CDK10 所呈現的抑癌基因功能[2，4-5，7-10，13-14]。本課題組前期研究[5，13-14]中應用免疫組化對CDK10 蛋白在乳腺癌和胃癌組織中的表達狀態進行了檢測，發現CDK10表達缺失與淋巴結轉移、臨床分期和患者總生存期密切相關，CDK10 表達可作為患者預后評判的獨立指標。目前，對于CDK10 在不同種類惡性腫瘤中發揮差異性作用的具體機制鮮有相關報道。這種差異性可能同CDK10 作為主導基因在細胞周期進程中受到諸多信號通路的精細控制，調節眾多從屬基因協調表達從而在不同組織來源的腫瘤中產生不同的功能有關。此外，不同的腫瘤微環境也可能是造成CDK10 表現差異性的原因之一。今后，擴大臨床檢測樣本量、進行細胞與動物實驗和分子機制檢測是深入研究CDK10 在食管鱗癌中具體作用的方向。明確CDK10 與食管鱗癌臨床病理和預后因素的關系，不僅有助于改善食管鱗癌臨床診斷的準確性，而且可提供更為敏感高效的食管鱗癌預后評價指標，從而指導臨床醫生為患者制訂更加完善的個體化治療方案，提高食管鱗癌的整體治療水平。