從ADAM33基因T2位點多態性分析小兒支氣管哮喘易感性及其嚴重程度的關系

李曉, 張磊，湯昱，許春娜

支氣管哮喘是一種由多種細胞組分、細胞參與的呼吸科疾病[1]，常發于兒童群體，患兒多有胸悶、流涕、陣發性咳喘等癥狀，治療不當會引發煩躁恐懼、大汗淋漓等癥狀，反復發作下會對其生長發育、身心健康不利。有研究表示該病的遺傳易感性較為明顯[2]，常會出現家族式聚集。隨著克隆技術、基因技術的進步，目前已發現人體內整合素-金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)具有遺傳易感性。為找出支氣管哮喘與ADAM33 T2位點多態性有無相關性，以為后續研究提供資料，本文討論如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2017年1月至2019年3月本院收診的支氣管哮喘患兒47例為觀察組，其中男26例，女21例；年齡4～13歲，平均(7.45±0.62)歲；重度哮喘15例，中度17例，輕度15例。同期選取健康體檢兒童47例為對照組，其中男25例，女22例；年齡3～13歲，平均(7.51±0.59)歲。兩組研究對象在性別、年齡方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照《支氣管哮喘基層診療指南(2018年)》[3]中有關于支氣管哮喘的診斷標準。哮喘嚴重程度：(1)輕度：1周有≥2 d(非每天)出現日間癥狀，且活動輕微受限；(2)中度：1周每天均會出現日間癥狀(非持續)，且活動部分受限；(3)重度：1周每天會持續出現日間癥狀，且活動嚴重受限[4]。

1.3 納入標準 (1)符合支氣管哮喘的診斷標準；(2)年齡3～13歲；(3)患兒家長已完成知情同意書的簽署流程，并經本院倫理委員會審核通過。

1.4 排除標準 (1)并發肺間質性疾病、肺結核、心源性哮喘者；(2)臨床病歷資料未完全獲取者；(3)存在肺部腫塊者。

1.5 脫落與剔除標準 (1)檢測期間出現嚴重不良事件者；(2)患兒家長主動撤回知情同意書。

1.6 方法 基因組提取：針對所有受試患兒，抽取肘靜脈血3 mL，行乙二胺四乙酸抗凝、冷藏保存操作。通過細胞裂解液對樣本進行裂解，離心沉淀完成需以蛋白酶K實施兩次溶解。若溶液仍相對渾濁，表示其裂解程度一般，需再次實施有效裂解。酒精洗脫后進行離心處理，再對患兒的DNA濃度、純度作相應檢查，最后做好冷藏保存工作。基因組提取后，通過Labcycler型PCR儀(德國Sensoquest)進行有效PCR反應，再行限制性片段長度多態性分析(聚合酶鏈式反應)，主要以限制性內切酶NaR1實施。整體酶切體系中，20 μL總體系包括10×Buffer液2 μL、去離子水7 μL、限制性內切酶1 μL以及PCR產物(成功擴增)10 μL，于溫箱(37 ℃)中進行酶切過夜處理，電泳時間維持為30 min，再通過凝膠成像儀行相應保存。已擴增的PCR產物測序完成后，通過BLAST軟件(NCBI)對測序結果進行同源性分析，對其測序結果正確性進行驗證。

1.7 觀察指標 評測分析兩組平衡定律(Hardy-Weinberg)、T2位點等位基因頻率，觀察其支氣管哮喘嚴重程度與T2位點多態性有無相關性。

1.8 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗；單變量Logistic回歸用于支氣管哮喘與T2基因位點多態性的相關性分析；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組平衡定律檢驗詳情的調查 T2位點基因頻率上，兩組研究對象均有較好的群體代表性，均滿足平衡定律(Hardy-Weinberg)。見表1。

表1 兩組平衡定律檢驗詳情對比

2.2 兩組基因頻率分布詳情的調查 T2位點等位基因中，觀察組A的基因頻率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，其中罹患支氣管哮喘的高危因素是A等位基因增加。見表2。

表2 兩組基因頻率的分布詳情對比[n(%)]

2.3 哮喘患兒嚴重程度與其T2位點多態性的調查 T2位點等位基因中，重度哮喘患兒AG基因型頻率與中度哮喘患兒比較，差異無統計學意義(P>0.05)；重度和中度哮喘患兒AG基因型頻率均高于輕度哮喘患兒，差異有統計學意義(P<0.05)，提示支氣管哮喘是否嚴重的高危因素是AG等位基因增加。見表3。

表3 哮喘患兒嚴重程度與其T2位點多態性對比

3 討論

支氣管哮喘患兒的發病因素一般與水產、牛奶、花粉、塵螨、非甾體類抗炎藥、冷空氣、劇烈運動、呼吸道感染等有關，是一種發作時通常有喘鳴音、呼吸時間延長、呼吸困難等癥狀的氣道慢性炎癥疾病[5-6]。支氣管哮喘易感人群的修復周期較長，且修復效率較低，長時間處于炎癥狀態會引發氣道重構，影響患兒健康[7]。臨床認為盡早對支氣管哮喘的遺傳具體機制進行探索較為關鍵，ADAM33基因屬于ADAM基因家族，后者在細胞信號傳導、金屬蛋白酶活性調控、細胞融合等方面扮演著重要角色，其中金屬蛋白酶活性可破壞肺泡組織結構的完整性，降低各項肺功能指標，影響著小兒支氣管哮喘發生、發展進程，經多年研究與分析，哮喘發病研究領域中ADAM33的地位得到有效確立[8]。現階段國外研究認為其T1、M+I、F+I、V4、T2等位點基因多態性與支氣管哮喘疾病的發生存在一定關聯，但由于此次研究涉及遺傳基因，應考慮種族人群差異的影響，加之國內漢族人口較多，有研究顯示T2單核酸苷多態性與漢族支氣管哮喘人群易感性存在相關性，能夠對漢族患病率、病情預后及死亡率進行判斷，故僅對研究深入性不足的T2位點多態性進行相關性分析[9]。

本文結果中，T2位點等位基因中，罹患支氣管哮喘的高危因素是A等位基因增加。T2位點主要位于ADAM33基因的第20外顯子上，堿基變化上的C由T代替，進而可將氨基酸(第774個)由Pro轉換為Ser。支氣管哮喘與該位點的基因多態性存在相關性，這與易感人群存在明顯遺傳傾向有關，種族不一的情況下其所攜帶的基因亦不相同，故大多屬于家族史發病[9]。于水蓮等[10]研究認為ADAM33基因與哮喘癥狀的嚴重程度存在一定關系，若哮喘患兒的癥狀越嚴重，那么ADAM33 mRNA的表達水平亦會相應上升，這與本文結果基本一致。本文中該位點的基因多態性與AG等位基因增加存在明顯相關性，能夠針對患兒的支氣管哮喘嚴重程度進行區別，臨床可基于此做好其對癥用藥工作，以此提升患兒的診療安全性。本次研究未深入分析T1、M+I、F+I、V4等位點基因與小兒支氣管哮喘易感與嚴重程度之間的關系探討，此為本研究不足之處，仍應于后期研究中不斷探討其相關性，以最大限度找出支氣管哮喘發病與ADAM33基因存在聯系的具體基因位點，進而做好風險防范工作。

綜上所得，支氣管哮喘與ADAM33 T2位點多態性存在相關性，其AG基因型頻率、A的基因頻率均會致使兒童罹患該病，臨床需做好相關檢測工作，以便盡早預防。