小兒難治性肺炎支原體肺炎臨床特征及免疫機制研究

劉月梅，張磊，趙二要，王靜，董利利

肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)由肺炎支原體引起的一種肺部疾病，是兒童呼吸道感染最常見的病原體之一，通常大環內酯類抗生素即可有效治療肺炎支原體，一旦經抗生素治療7 d后病情仍未好轉的患兒很有可能發展為難治性肺炎支原體肺炎(refractory mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP)，表現為病情遷延不愈、肺部癥狀及胸部影像學進行性加重[1-2]。RMPP的發病機制目前尚未明確，研究者們認為與機體免疫反應過度表達、機體耐藥性及細胞免疫介導的炎癥反應是RMPP的主要發病機制。為充分了解RMPP患兒機體免疫變化，研究者收集患兒支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)觀察T淋巴細胞亞群及細胞因子表達水平變化，可溶性共刺激分子B7-H3(solubleco-stimulatory molecule B7-H3，sB7-H3)參與外周免疫調節，與炎癥反應關系密切，故本研究將其作為觀察指標，分析RMPP患兒BALF中各因子表達水平。

1 對象與方法

1.1 研究對象 以2017年3月至2019年3月本院收治的RMPP患兒92例為觀察組，按1∶2同期收集46例普通肺炎患兒為對照組。觀察組中男52例，女40例；年齡3～14歲，平均(6.7±1.3)歲。對照組中男27例，女19例；年齡3～14歲，平均(6.5±1.2)歲。兩組患兒在性別、年齡方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015年版)》中相關診斷標準[3]。

1.3 納入標準 (1)符合RMPP的診斷標準；(2)年齡3～14歲；(3)BALF中肺炎支原體DNA>1.0×104copies/mL；(4)應用大環內酯類抗生素治療≥7 d肺部癥狀及胸部影像學持續進展；(5)患兒家屬知情同意。

1.4 排除標準 (1)入組前2周內使用糖皮質激素；(2)痰培養顯示細菌、真菌生長；(3)存在混合感染。

1.5 方法 進行支氣管鏡檢查前評估患兒是否適合支氣管鏡檢查，術前4 h囑患兒禁食、禁水，術前30 min給予2%利多卡因進行局部麻醉。患兒進入支氣管鏡檢查室后取平臥位，清理鼻腔，咪達唑侖針鎮靜，丁卡因膠漿涂抹鏡管。支氣管鏡為BF-IT290(Olympus)型，經一側鼻孔進鏡，電子支氣管鏡到達病變部位時進行灌洗，對體質量≤20 kg患兒灌洗量為1 mL/kg，>20 kg患兒每次灌洗量為2 mL/kg，灌洗液總量≤10 mL/kg，將無菌痰液收集器連接于支氣管鏡操作孔道，負壓抽吸獲取灌洗液標本。負壓范圍如下：13.3～26.6 kPa(100～200 mm Hg)，每次灌洗液回收率≥40%、紅細胞<20%且無大氣道分泌物混入為合格標本。留取的灌洗液分裝于離心管中，經離心處理后留取上清液，剩余標本置于-20 ℃冰箱內保存。如肺部病灶吸收不理想，1周后再次行支氣管鏡灌洗液收集。根據患兒急性期支氣管鏡下表現從黏膜、分泌物、管腔三方面分為2組。RMPP重度組表現為黏膜糜爛、小結節樣凸起及壞死，大量黏液性分泌物，管腔變形或閉塞；RMPP輕度組表現為黏膜充血腫脹、縱行皺，大量漿液性分泌物。

1.6 觀察指標 采用上轉發光法檢測BALF中白細胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、IL-6，試劑盒購自北京熱景生物技術股份有限公司；采用雙抗體夾心ELISA測定腫瘤壞死因子ɑ(tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)，試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司，應用流式細胞儀(美國Becton Dickinson)檢測BALF中T細胞亞群水平。采用雙抗體夾心法檢測sB7-H3，試劑盒購自上海一研生物科技有限公司。

2 結果

2.1 3組T細胞亞群水平比較 見表1。

表1 3組T細胞亞群水平比較

表1結果表明，RMPP重度組的CD3、CD4水平及CD4/CD8值均顯著低于RMPP輕度組、對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)，但RMPP重度組的CD8水平與RMPP輕度組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。RMPP輕度組CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值均顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 3組細胞因子及sB7-H3表達情況比較 見表2。

表2 3組細胞因子水平及sB7-H3表達情況比較

表2結果表明，RMPP重度組IL-5、IL-6及TNF-ɑ水平均顯著高于RMPP輕度組、對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)，但RMPP重度組sB7-H3水平與RMPP輕度組比較差異無統計學意義(P>0.05)。RMPP輕度組IL-5、IL-6及TNF-ɑ、sB7-H3水平均顯著高于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

RMPP的發生可能與肺炎支原體的耐藥性、氣道黏液高分泌等有關，經相關研究表明[4]，肺炎支原體可使淋巴細胞克隆活化導致細胞增殖，導致體內T細胞亞群比例失調，表現為CD4/CD8比例失衡，從而引起免疫功能紊亂，促進疾病發展。患兒在感染肺炎支原體后機體會產生TNF-ɑ、IL-6等促炎因子，以清除病原微生物[5]，IL-5對B細胞沒有明顯的刺激作用，其主要功能是刺激嗜酸性粒細胞增殖、分化及活化，與IL-6、TNF-ɑ、sB7-H3等參與機體的多種生理及病理反應[6]。因上述研究因子與機體MPP的發生有一定關聯，因此臨床可通過分析患兒肺泡灌洗液中的免疫因子及細胞因子判斷病情變化。為充分分析不同嚴重程度患兒的各項因子水平變化，本研究以92例RMPP患兒為研究對象并分為2組，且以普通肺炎患兒為對照組，充分分析在不同疾病嚴重程度、非RMPP肺炎患兒中，CD3、CD4水平及CD4/CD8及相關細胞因子水平變化。結果顯示，RMPP患兒的CD3、CD4水平及CD4/CD8值與對照組存在較大差異，RMPP重度組水平最低。研究者認為有以下因素：CD4細胞又稱為輔助性T淋巴細胞，可促進B細胞、T細胞增殖、分化，發揮免疫效應功能[7-8]；CD8細胞又稱為細胞毒性T淋巴細胞，可直接殺傷靶抗原，而T淋巴細胞除CD3分子外，其他分子的表面標志物及生物學功能不同，還會分出許多亞群，在機體感染肺炎支原體后，細胞增殖加快，T淋巴細胞亞群失調，表現為CD4/CD8比例失衡[9-10]。因此研究者認為，T淋巴細胞亞群及相關細胞因子在肺炎支原體感染疾病中的關鍵作用。在比較不同組的細胞因子水平及sB7-H3表達情況，RMPP重度組IL-5、IL-6及TNF-ɑ水平及sB7-H3均顯著高于對照組，分析原因，應與sB7-H3在健康者體內表達量較低有關。此外，sB7-H3為T細胞的輔助性刺激因子[11]，但目前對其調控Th細胞分化并未有統一意見，有研究表示，sB7-H3可刺激T細胞，同時也可抑制T細胞，盡管正常機體中該因子含量較少，一旦在機體發生感染后其水平明顯升高，尤其是呼吸系統疾病[12-13]。因此肺炎支原體感染患兒的sB7-H3顯著高于對照組，但與疾病嚴重程度并無明顯聯系，研究者猜想，在后期的研究中或許可以利用sB7-H3表達判斷是否為肺炎支原體感染。

綜上所述，RMPP患兒BALF中T淋巴細胞亞群及炎性相關因子表達與癥狀有一定聯系，隨著病情的加重，炎性因子IL-5、IL-6、TNF-ɑ增高，sB7-H3可能參與機體免疫機制及炎性反應。下次研究應選取大樣本進一步分析影響疾病進展的因素，并深入探討不同因子在評估RMPP的預后效能，為臨床治療提供參考。