miRNAs小鼠哮喘模型中的作用初探

張冬姣，徐浩

哮喘個體免疫反應的改變可歸因于遺傳和表觀遺傳的改變[1-2]。MicroRNAs(miRNAs)是基因表達的轉錄后調節因子，在發育和炎癥性疾病中受到不同的調節[3-4]。在過敏性氣道疾病中，miRNAs的作用可以明顯影響全身炎癥反應和組織反應[5]。本研究利用動物模型來探討miRNAs在哮喘發病機制中的作用，希望進一步了解miRNAs在哮喘中的特定作用。

1 材料方法

1.1 動物 選取6～8周齡，體質量18～20 g的BALB/c小鼠24只[SYXK(遼)2010-0002]，按隨機數字表法分為正常對照組、卵清蛋白處理組、地塞米松治療組各8只。

1.2 給藥方法 (1)正常對照組：在飼養的第1、7、14天使用200 μL含1 mg的氫氧化鋁的磷酸鹽緩沖液(phosphate belanced solution，PBS)作為佐劑注射，第22～25天通過鼻腔吸入的方式給予小鼠鼻內吸入20 μL的PBS。(2)卵清蛋白處理組：在飼養的第1、7、14天使用20 μg乳化的卵清蛋白+200 μL含1 mg的氫氧化鋁的PBS作為佐劑注射，第22～25天通過鼻腔吸入的方式給予小鼠鼻內吸入20 μL含有100 μg的卵清蛋白的PBS。(3)地塞米松治療組：在飼養的第1、7、14天使用20 μg乳化的卵清蛋白+200 μL含1 mg的氫氧化鋁的PBS作為佐劑注射，第22～25天通過鼻腔吸入的方式給予小鼠鼻內吸入20 μL含有100 μg的卵清蛋白的PBS，并且給小鼠腹腔注射2 mg/kg的地塞米松。

1.3 肺泡灌洗液的收集 實驗完成后使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，隨后頸椎脫臼法處死小鼠。剖開頸部并暴露氣管，夾住遠端氣管，將滯留針插入氣管中；使用1 mL注射器吸0.8 mL預冷的PBS，通過滯留針緩慢注射于肺中，并輕柔按摩肺部10 s后吸出；將兩次收集的灌洗液離心，1 500 r/min，離心10 min，離心半徑6 cm，將上清儲存于-80 ℃冰箱待用。

1.4 炎癥細胞的計數 使用血細胞分析儀分析支氣管肺泡灌洗液中各種炎癥細胞(嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)、嗜中性粒細胞(neutrophil，NEU)、巨噬細胞(macrophage，MAC)和淋巴細胞(lymphocyte，LYM))的數量。

1.5 酶聯免疫吸附測定(ELISA) 使用ELISA試劑盒檢測肺泡灌洗液中的白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、IL-5和IL-13的表達水平。加一定稀釋的待檢樣品100 μL于已包被的96孔孔板中，37 ℃孵育1 h。洗滌后加入酶標抗體100 μL。37 ℃孵育1 h，洗滌。加入3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺底物100 μL，37 ℃孵育30 min。終止反應，然后使用酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度。

1.6 標本送檢 每組取3只小鼠的肺組織1 cm剪碎，通過1 mL Trizol裂解，使用氯仿、異丙醇抽提獲取總RNA。采用焦碳酸二乙酯水溶解后，送至沈陽匯佰生物科技有限公司進行miRNA基因芯片檢測。

1.7 實時定量PCR TRIZOL法提取肺組織中的總RNA，反轉錄成cDNA，進行實時PCR。所用引物為miR-455，F(5′-3′)：TAA GAC GTC CAT GGG CAT，R(5′-3′)：GTG CAG GGT CCG AGG T；U6，F(5′-3′)：CTC GCT TCG GCA GCA CA，R(5′-3′)：ACG CTT CAC GAA TTT GC。

2 結果

2.1 哮喘對于炎癥細胞的影響 卵清蛋白處理組小鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC和LYM高于正常對照組，地塞米松治療組炎癥細胞含量低于卵清蛋白處理組，差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 炎癥細胞的表達情況

2.2 哮喘對于細胞因子的影響 見表2。

表2 細胞因子的表達情況

表2結果表明，卵清蛋白處理組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13的表達顯著高于正常對照組，地塞米松治療組細胞因子含量低于卵清蛋白處理組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 哮喘對于miRNAs表達情況的影響 卵清蛋白處理組的肺組織中miR-34和miR-155表達低于正常對照組，miR-21、miR-455和miR-126表達高于正常對照組0.497±0.174，且地塞米松治療后這些miRNAs恢復到正常水平，見表3。

Real-time PCR結果發現，miR-455在卵清蛋白處理組為0.734±0.090，顯著高于正常對照組0.497±0.174，地塞米松治療后miR-455基本恢復到正常水平(0.426±0.256)，差異有統計學意義(F=4.9，P<0.05)。

表3 miRNAs差異性表達情況

2.4 miR-455與炎癥因子的相關性 統計分析數據指出，miR-455與EOS、NEU、MAC和LYM的表達均呈正相關，結果見圖1。

2.5 miR-455與細胞因子的相關性 統計分析數據指出，miR-455與IL-4、IL-6和IL-13的表達均呈正相關，結果見圖2。

圖1 miR-455與炎癥因子的相關性分析

圖2 miR-455與細胞因子的相關性分析

3 討論

miRNAs在調節細胞活動中起著關鍵作用。據估計，它們可以調節超過60%的蛋白質編碼基因。miRNAs通過與靶mRNA轉錄本上的互補同源序列部分結合來調節基因表達，從而抑制蛋白質翻譯或mRNA降解[6]。miRNAs在血液循環中大量存在，一些miRNAs被認為是診斷、預后和監測癌癥及其他疾病治療結果的有效工具[6]。某些miRNAs被認為在哮喘發病機制中起作用[7]。研究指出在哮喘發病過程中，miRNAs通過調節Th2的存活、活化、增殖、分化和發育來控制過敏性免疫反應的強度[8]。一些miRNAs通過靶向銜接蛋白和轉錄因子參與了巨噬細胞激活和極化的調節。研究指出，哮喘模型血清中miRNA-29b-3p、miRNA-145-5p、miRNA-146a-5p、miRNA-147b、miRNA-155、miRNA-193a、miRNA-500a、miRNA-502、miRNA-511下調，miRNA-147b、miRNA-181a/b上調，促進巨噬細胞M1的激活[9]。本研究旨在探討小鼠哮喘模型中異常表達的miRNAs，希望探討哮喘的發病機制，為哮喘的早期診斷和治療提供新的可能。

本研究在構建了小鼠哮喘和治療模型后，通過細胞分析和ELISA方法指出，卵清蛋白處理組肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC、LYM、IL-4、IL-6和IL-13的表達顯著上調，地塞米松治療后各種炎癥細胞和細胞因子與卵清蛋白處理組比較表達下調明顯。miRNAs芯片分析結果指出，多種miRNAs在卵清蛋白處理后出現異常表達的現象，其中miR-34和miR-155表達出現下調現象，miR-21、miR-455和miR-126存在表達上調現象。這些miRNAs中，miR-155已經被證明對于哮喘的發生具有調節作用[7-8]，本研究中篩選出差異性最為明顯的miR-455目前在哮喘中的作用尚無明確報道。

miR-455已經在多種腫瘤中被證明發揮重要作用[10-12]，血清miR-455-3p被證明可以作為乳腺癌的生物標志物在乳腺癌的調節中發揮重要作用，通過靶向SOCO3促進非小細胞肺癌細胞的生長和侵襲，促進食管鱗狀細胞癌的耐藥性和侵襲性。在肺部疾病中轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)可誘導肺成纖維細胞產生miR-455，miR-455可以通過靶向刺激Ago2-IP的富集激活的成纖維細胞中的TGF-β1和Wnt途徑，促進肺部疾病的進程[13]。本研究中發現miR-455的表達情況與小鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC、LYM、IL-4、IL-6和IL-13的表達呈正相關，推斷miR-455可能通過調節炎癥反應參與哮喘的進程。我們推斷哮喘過程中TGF-β1可能通過促進miR-455的表達，促進炎癥發展、加劇哮喘程度。

本研究表明，miR-455在卵清蛋白誘導的小鼠哮喘模型中顯著上調，本研究為哮喘的治療提供了新的可能。