PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA水平聯(lián)合檢測對早期胃癌的診斷價(jià)值

趙 勇，曾瑋榮，曾俊峰

武漢市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430060

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一[1]。腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的基因表達(dá)譜與健康志愿者相比有明顯差異[2]。非結(jié)構(gòu)蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)在DNA復(fù)制過程中起DNA修復(fù)調(diào)節(jié)作用[3]。YUAN等[4]發(fā)現(xiàn)PBMCs中的NS5ATP9 mRNA水平和蛋白水平均顯著上調(diào)。白細(xì)胞介素-12p40(IL-12p40)是構(gòu)成白細(xì)胞介素-12(IL-12)異源二聚體的兩條鏈之一[5]。白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1(IRAK-1)在啟動(dòng)針對外來病原體的先天免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[6]。SIEDLAR等[7]發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者的PBMCs中IL-12p40和IRAK-1的mRNA水平受到明顯的抑制。然而，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA水平聯(lián)合檢測對早期胃癌的診斷價(jià)值尚未見報(bào)道，故本研究對此進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年11月至2019年11月本院收治的早期胃癌患者112例作為早期胃癌組；其中男55例、女57例，年齡37～79歲、平均(48.05±23.05)歲，腫瘤最大徑1.3～6.4 cm、平均(3.76±2.04)cm，TNM分期：Ⅰ期81例、Ⅱ期31例。將同期本院收治的胃部良性疾病患者112例作為良性組；其中男63例、女49例，年齡35～81歲、平均(46.39±21.04)歲，胃潰瘍54例、淺表性胃炎38例、萎縮性胃炎20例。112例早期胃癌患者和112例胃部良性疾病患者均經(jīng)本院病理科證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心、肝、腎功能損傷者；(2)長期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者；(3)患有精神疾病者；(4)患有其他癌癥者。另外，將同期于本院進(jìn)行體檢的體檢健康者112例作為對照組；其中男56例、女56例，年齡32～74歲、平均(45.70±19.97)歲。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入研究者均簽署知情同意書。

1.2方法 抽取上述三組人群(早期胃癌和良性組患者于治療前)肘前靜脈血15 mL。使用北京綠源伯德生物科技有限公司的PBMC細(xì)胞提取試劑盒提取PBMCs,使用北京源暢致和生物科技有限公司的RNA提取試劑盒(RNAsimple總RNA提取試劑盒)進(jìn)行總RNA抽取。使用微克特銳生物科技(武漢)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。使用廣州鋮銨生物科技有限公司的SYBR green試劑和表1中的引物進(jìn)行NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA相對水平檢測。所有反應(yīng)一式三份，去掉極大值和極小值，以2-ΔΔCT進(jìn)行mRNA相對水平的計(jì)算。

表1 NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的引物序列(5′-3′)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，方差齊者采用t檢驗(yàn)比較，方差不齊者采用Tamhane′T2法比較。應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC曲線)下的面積(AUC)分析PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1檢測早期胃癌的臨床診斷價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1三組間PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相對水平的比較 三組間NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相對水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組間PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相對水平的比較

2.2三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)用于早期胃癌與胃部良性疾病鑒別診斷的效能 NS5ATP9的AUC為0.89(95%CI：0.85～0.94)，以0.939 7為診斷界值，靈敏度和特異度均為91%；IL-12p40的AUC為0.86(95%CI：0.81～0.91)，以0.119 8為診斷界值，靈敏度為87%，特異度為88%；IRAK-1的AUC為0.92(95%CI：0.88～0.97)，以2.095 0為診斷界值，靈敏度為93%，特異度為92%。見圖1、表3。

表3 三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)用于早期胃癌與胃部良性疾病鑒別診斷的效能

圖1 三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)用于早期胃癌與胃部良性疾病鑒別診斷的ROC曲線

2.3三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)用于區(qū)分早期胃癌患者與體檢健康者的診斷效能 NS5ATP9的AUC為0.95(95%CI：0.92～0.98)，以0.070 4為診斷界值，靈敏度、特異度分別為96%、94%；IL-12p40的AUC為0.91(95%CI：0.86～0.96)，以0.030 7為診斷界值，靈敏度、特異度分別為92%、91%；IRAK-1的AUC為0.96(95%CI：0.93～0.99)，以0.085 9為診斷界值，靈敏度和特異度均為95%。見圖2、表4。

表4 三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)用于區(qū)分早期胃癌患者與體檢健康者的診斷效能

圖2 三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)用于區(qū)分早期胃癌患者與體檢健康者的ROC曲線

2.4三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)對早期胃癌的聯(lián)合診斷結(jié)果 患有早期胃癌的為真陽性，未患有早期胃癌的為真陰性。NS5ATP9以0.939 7為診斷界值，IL-12p40以0.119 8為診斷界值，IRAK-1以2.095 0為診斷界值，三項(xiàng)均為陽性則聯(lián)合診斷陽性，反之則為聯(lián)合診斷陰性。三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷早期胃癌的靈敏度為92.86%(104/112)，特異度為93.30%(209/224)，準(zhǔn)確度為93.15%(313/336)，見表5。

表5 三項(xiàng)PBMCs mRNA指標(biāo)聯(lián)合對早期胃癌的診斷結(jié)果(n)

3 討 論

自2008年以來，胃癌已被列為全球第四大最常見的惡性腫瘤，每年估計(jì)有980 000例新病例和738 000例與癌癥相關(guān)的死亡病例[8]。胃癌的發(fā)病率因國家而異，東亞國家發(fā)病率最高。胃癌的預(yù)后很差，因?yàn)樵S多患者確診時(shí)已經(jīng)為疾病晚期，沒有手術(shù)治愈的可能。因此，迫切需要開發(fā)新的生物標(biāo)志物，特別是非侵入性的替代生物標(biāo)志物，用于早期胃癌的診斷，從而改善預(yù)后。此外，篩選出可用于預(yù)測胃癌患者臨床結(jié)局的新型分子標(biāo)志物也有助于制訂更好的治療策略來有效控制該疾病。盡管已有幾種腫瘤生物標(biāo)志物，如癌胚抗原(CEA)和糖類抗原19-9(CA19-9)，用于胃癌的診斷或預(yù)后判斷，但均未顯示出理想的敏感性和/或特異性[9]。因此，迫切需要更特異、敏感的腫瘤生物標(biāo)志物對早期胃癌進(jìn)行診斷。本研究對早期胃癌組、良性組和對照組受試人員血液中PBMCs的NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA表達(dá)量進(jìn)行了檢測，并通過ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA的聯(lián)合檢測對早期胃癌診斷的靈敏度為92.86%，特異度為93.30%，準(zhǔn)確度為93.15%。

PBMCs是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，包括單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。本研究中發(fā)現(xiàn)，早期胃癌患者、胃部良性疾病患者和體檢健康者PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA水平有明顯差異。與以前的血液中的標(biāo)志物相比，PBMCs中的mRNA能夠更加穩(wěn)定地存在[10]。PBMCs表達(dá)人類基因組編碼的大約80%的基因，這些基因?qū)υ诤暧^和微觀環(huán)境中發(fā)生的機(jī)體變化做出響應(yīng)[11]。近年來，人們越來越多地探索了它們在評估人體生物學(xué)狀態(tài)方面的用途。例如，已經(jīng)證明PBMCs中基因表達(dá)的改變可反映人體的惡性腫瘤[12]。癌細(xì)胞與PBMCs之間的相互作用非常復(fù)雜，涉及免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別和腫瘤對免疫系統(tǒng)的逃避。因此，本研究創(chuàng)新性地使用PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA作為指標(biāo)來評估其對早期胃癌的診斷價(jià)值。

NS5ATP9是一種相對分子質(zhì)量為15×103的蛋白質(zhì)，含有保守的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合基序[3]。NS5ATP9用于早期胃癌與胃部良性疾病鑒別診斷的靈敏度和特異度均為91%，用于區(qū)分早期胃癌患者與體檢健康者的靈敏度和特異度分別為96%和94%。NS5ATP9蛋白在許多不同類型的人類惡性腫瘤組織中過表達(dá)，包括肝細(xì)胞癌、乳腺癌、肺癌、腎上腺和胰腺腫瘤，表達(dá)水平與患者預(yù)后不良有關(guān)[13]。此外，體外研究表明NS5ATP9的過表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，小干擾RNA引起的NS5ATP9的水平降低導(dǎo)致細(xì)胞活力的降低[14]，表明NS5ATP9在癌變和癌癥的發(fā)展中起著重要的作用。

IRAK-1是參與核因子κB(NFκB)/活化蛋白-1(AP-1)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)依賴性促炎蛋白合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵激酶之一，特別是在脂多糖、脂肽、透明質(zhì)酸、熱休克蛋白或壞死細(xì)胞等刺激單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞后[15]。本研究中用于早期胃癌與胃部良性疾病的鑒別診斷，IL-12p40、IRAK-1的靈敏度分別為87%、93%，特異度分別為88%、92%。用于區(qū)分早期胃癌患者與體檢健康者，IL-12p40、IRAK-1的靈敏度分別為92%、95%，特異度分別為91%、95%。由于IRAK-1是信號級聯(lián)反應(yīng)中必不可少的分子，因此其下調(diào)會阻礙信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及對腫瘤壞死因子(TNF)和IL-12p40生成的誘導(dǎo)作用[16]。用胰腺癌細(xì)胞刺激人單核細(xì)胞會導(dǎo)致IRAK-1蛋白表達(dá)的顯著抑制，這與腫瘤細(xì)胞再刺激后TNF和IL-12p40的生成減少有關(guān)，但與IL-10的生成無關(guān)[17]。因此，IRAK-1蛋白表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控，促進(jìn)了胃癌的發(fā)展。

與周麗華等[18]報(bào)道的血清親環(huán)素B(CypB)76.36%的靈敏度，75.51%的特異度相比，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1聯(lián)合對早期胃癌診斷的靈敏度為92.86%，特異度為93.30%，準(zhǔn)確度為93.15%，具有較高的診斷價(jià)值。與劉云云等[19]報(bào)道的靛胭脂染色內(nèi)鏡診斷早期胃癌相比，本研究的聯(lián)合診斷除了具有靈敏度和特異度的優(yōu)勢外，還具有操作簡便的特點(diǎn)。

綜上所述，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA是早期胃癌診斷的潛在標(biāo)志物。但本研究仍然有不足之處，如各組納入的樣本量較少，還需繼續(xù)增加樣本量并進(jìn)一步地進(jìn)行研究。