基于CYP2C9與VKORC1基因多態性的心臟瓣膜置換術后華法林個體化給藥劑量預測的3種模型算法比較

陳幽攸,任小群，楊 探，李華云，代 顏△

西南醫科大學附屬醫院：1.藥學部；2．心臟大血管外科，四川瀘州 646000

華法林是臨床常用的香豆素類抗凝藥物，主要通過拮抗維生素K起效，適用于預防靜脈血栓栓塞性疾病、房顫血栓栓塞與人工瓣膜置換術、瓣膜病等，但其治療窗狹窄，對個體的作用效果差異較大。抗凝治療的劑量不夠容易導致血栓形成，過度抗凝治療則會增加出血風險，這就需要找到抗凝治療劑量的平衡點。因此，選擇適宜患者個體的精確劑量是抗凝治療的關鍵[1-2]。

隨著藥物基因組學的發展，研究發現，華法林相關的藥物基因多態性會對其用藥方案產生影響。華法林在體內主要經細胞色素P450同工酶2C9(CYP2C9)代謝為無活性代謝產物，CYP2C9*2(c.430C>T,rs1799853)和CYP2C9*3(c.1075A>C,rs1057910)是CYP2C9發生了多態性位點突變的主要基因型，這兩種突變均會導致其酶活性降低，故攜帶變異基因的患者應降低華法林劑量以防止發生嚴重的藥物不良反應[3]。華法林的作用靶點為維生素K環氧化物還原酶復合體亞基1(VKORC1)，攜帶VKORC1基因啟動子區-1639G>A(rs9923231)單核苷酸變異的患者對華法林敏感性增加，需降低劑量[4-5]。因此，影響藥代動力學的CYP2C9與藥效動力學的VKORC1基因多態性是華法林相關藥物基因組學的研究重點，能解釋30%～60%的華法林對個體作用的差異。美國食品藥品監督管理局(FDA)也在華法林使用說明書中建議結合VKORC1和CYP2C9基因型考慮華法林的初始用藥劑量，將這兩個基因的多態性位點檢測結果結合多個臨床因素建立的遺傳藥理學劑量模型能在優化給藥方案中起指導作用[1,6-7]。目前，主要的模型算法包括國際華法林遺傳藥理學協會(IWPC)建立的華法林劑量計算公式[8]、由華盛頓醫學中心和美國國立衛生研究院等機構提供支持的Warfarin Dosing網站(http://www.warfarindosing.org)公布的計算公式及2015年由國家衛生和計劃生育委員會印發的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中提出的基于中國人群的華法林用藥劑量計算公式。本研究探討了瀘州及周邊地區漢族人群中CYP2C9與VKORC1基因型的分布頻率，并基于基因型檢測結果與患者個體信息，分別利用上述3種算法預測心臟瓣膜置換術后患者服用華法林的劑量，比較三者的差異，旨在為華法林個體化用藥的相關工作提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 從2018年6月至2019年7月在西南醫科大學附屬醫院心臟大血管外科行心臟瓣膜置換術(包括二尖瓣置換、三尖瓣置換、主動脈瓣置換、BenTall術等)后需長期使用華法林進行抗凝治療并進行了CYP2C9 430、1075和VKORC1-1639位點基因檢測的瀘州及周邊地區漢族住院患者中，共獲取有效病例120例并納入研究，其中女72例、男48例，年齡19～75歲，平均(52.28±9.75)歲，對本研究均知情同意。為計算華法林個體化用藥劑量，收集患者性別、年齡、身高、體質量、適應證、吸煙史、肝功能、合并用藥情況等生理、病理信息。

1.2儀器與試劑 BIO-Ⅱ-A生物安全柜(Telstar Industrial公司)、K30干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)、Sorvall ST 8R高速冷凍離心機(Thermo Electron LED GmbH公司)、XP基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)；BR-526-24全自動雜交儀、BE-2.0生物芯片識讀儀、核酸提取試劑盒、CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測試劑盒(PCR-芯片雜交法)、免疫顯色試劑盒均購自上海百傲科技有限公司。

1.3方法

1.3.1CYP2C9和VKORC1的基因檢測 取受檢者外周靜脈血2 mL至EDTA抗凝管中，采用DNA提取純化試劑盒抽提DNA。在擴增液中加入待測DNA溶液與反應液A，在PCR儀中按程序擴增，定期進行陽性、陰性對照品試驗以確保結果準確性。采用微陣列基因芯片法在全自動雜交儀上按照CYP2C9和VKORC1檢測雜交程序運行。使用生物芯片識讀儀檢測基因芯片，ArrayDoctor軟件掃描信號判讀CYP2C9和VKORC1基因型。

1.3.2華法林個體化劑量計算及比較 基于患者的生理病理信息分別利用以下3種算法計算其華法林個體化劑量：(1)IWPC公式；(2)Warfarin Dosing網站；(3)《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中的基于中國人群的華法林用藥計算公式(以下簡稱中國公式)。對5種基因型患者3種算法的計算劑量進行比較，同時將3種算法計算劑量的平均值進行比較，并且與FDA在華法林原研藥COUMADIN?說明書中推薦的劑量范圍[9]進行比較。Warfarin Dosing網站不支持20歲以下患者的劑量預測，為便于比較，本研究將19歲的患者以20歲計算。

2 結 果

2.1多態性位點的基因型頻率分布 120例患者中共檢出了5種基因型組合，未檢出CYP2C9*2。CYP2C9 1075位點AA與AC型的患者分別占90.83%(109/120)和9.17%(11/120)，VKORC1-1639位點AA、AG、GG型的患者分別占88.33%(106/120)、10.83%(13/120)和0.83%(1/120)。所有基因型分布均通過了Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(P>0.05)，可進行后續分析，見表1。

表1 CYP2C9 430、1075位點和VKORC1-1639位點的基因型分布[n(%)]

2.23種算法得到的劑量比較 由3種算法計算劑量的平均值可看出，攜帶這5種基因型的患者中所需華法林劑量最高者為CYP2C9*1/*1 & VKORC1 GG基因型的患者，最低者為CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA基因型的患者。將3種算法計算劑量的平均值與FDA推薦的劑量進行比較，僅有CYP2C9*1/*1 & VKORC1 GG與CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AG基因型患者的平均計算劑量在FDA推薦的范圍內，但因該兩種基因型患者僅有1例，樣本量不足，而其他3種基因型患者的平均計算劑量均未在FDA推薦的劑量范圍內，說明該范圍不適用于中國人群。將CYP2C9與VKORC1基因型分類比較發現，VKORC1 AA、AG、GG基因型間計算劑量的差異大于CYP2C9*1/*3、*1/*1基因型間的差異，說明VKORC1-1639位點的變異比CYP2C9 1075位點的變異對華法林計算劑量的影響更大。見表2。

表2 5種基因型患者3種算法計算劑量的比較(mg/d)

2.3一致性分析 IWPC公式的計算劑量比中國公式平均高0.13 mg/d，見圖1。IWPC公式與中國公式的計算劑量差值在95%置信區間(CI)以外的概率為5.83%(7/120)；兩種計算方法差值的絕對值最大為0.98 mg/d；兩者計算劑量差值超過95%CI以外的患者中有4例患者是CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA基因型，另3例患者為CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA基因型。

注：虛線表示兩種算法預測劑量差值為0；中實線表示所有差值的平均值；上下實線表示差值的95%CI。

Warfarin Dosing網站計算的華法林劑量比中國公式的計算劑量平均低0.14 mg/d，見圖2。兩種算法計算劑量差值不在95%CI內的概率為4.17%(5/120)；兩種計算方法差值的絕對值最大為0.92 mg/d，該患者基因型為CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AG，因該基因型患者只有1例，該基因型患者用兩種方法計算所得結果差異較大的原因還有待進一步研究。除該患者外，計算劑量差值超過95%CI以外的4例患者中有2例患者基因型為CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA，另2例患者基因型分別為CYP2C9*1/*3 & VKORC1 AA和CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AG。對IWPC公式、Warfarin Dosing網站與中國公式算法的差值超出95%CI的患者進行對比，有1例患者的計算劑量差值在兩組一致性分析中均在95%CI以外，該患者年齡為19歲。

注：虛線表示兩種算法預測劑量差值為0；中實線表示所有差值的平均值；上下實線表示差值的95%CI。

3 討 論

作為心臟瓣膜置換術后用于終生抗凝治療的一線口服抗凝藥物，華法林的合理用藥一直是臨床關注的重點之一。對于行心臟瓣膜置換術后的患者而言，術后1個月是發生血栓栓塞及嚴重出血事件的高危時期[10-11]。目前，國內臨床上使用華法林的傳統方案為給予固定劑量(一般為2.5 mg/d)，然后通過監測國際標準化比值(INR)反復調整劑量。然而這種方案很難快速獲得理想的抗凝治療效果，在此期間患者形成血栓和出血的危險性很高。有學者報道，使用計算公式預測華法林個體化劑量能夠明顯改善患者短期預后，縮短達到治療所要求INR的時間，患者能在抗凝治療開始的1個月內明顯獲益[6,12]。

近年的藥物基因組學研究發現與華法林藥效學與藥物動力學相關的基因超過30種[13]。在歐洲人群患者中，CYP2C9、VKORC1與CYP4F2的常見變異可分別解釋18%、30%、11%的華法林穩定劑量的變化[6]。但目前國內進行個體化用藥相關的基因檢測的成本相對較高，出于成本-效益比的考慮，是否應對有影響的基因均進行檢測還有待商榷，而且還應考慮到不同人種間基因變異的流行程度。例如，相比Warfarin Dosing網站計算中包含的多個基因多態性因素，中國公式中僅納入了CYP2C9*3與VKORC1的基因多態性，就是因為中國人群中基本不會出現CYP2C9*2[14]。本研究中，也沒有檢出CYP2C9*2情況。在國家藥品監督管理總局網站(www.nmpa.gov.cn)上查詢到，獲得第三類醫療器械注冊證批件的華法林藥物代謝基因(CYP2C9 & VKORC1)多態性檢測體外診斷試劑盒共有7個，其中有5個試劑盒均包含了CYP2C9*2的檢測，事實上對于中國患者而言意義不大，會增加不必要的經濟成本，阻礙華法林個體化用藥基因檢測的應用。

除患者幾個基本信息外，3種模型算法所需的計算因素稍有區別。相同的計算因素為基因型、年齡、身高、體質量、人種。不同的計算因素：IWPC公式為合并用藥(酶誘導劑、胺碘酮)；Warfarin Dosing網站為有無吸煙史、肝功能、適應證、基礎INR、目標INR、合并用藥(胺碘酮、他汀類藥物、唑類抗真菌藥、磺胺甲噁唑等)；中國公式為有無吸煙史、性別、是否置換主動脈瓣膜、是否合并有房顫、合并用藥(阿司匹林、胺碘酮)。3種算法中所需計算因素最多的是Warfarin Dosing網站，除多個合并用藥的影響外，還考慮了除CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639外的其他基因變異，如CYP4F2、GGCX、CYP2C9*5、CYP2C9*6，也能利用患者基礎INR與目標INR獲得更準確的推薦；但因該模型主要基于外國人群建立，故中國公式的提出可能更適合中國人群華法林個體化劑量的計算，并將性別及部分病理狀態都納入了考量。

通過將中國公式與國際上普遍承認的IWPC公式與Warfarin Dosing網站的遺傳藥理學模型相比較，中國公式與后兩者均有較高的相關性。目前國內華法林鈉片的規格有1.0、2.5、3.0與5.0 mg，國外進口華法林鈉片規格有1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mg，但國內臨床上普遍使用的是2.5 mg規格，因此對大部分患者而言，3種公式間計算劑量的差異并不容易在實際服用劑量中體現，因此3種算法計算劑量的差異均在可接受的范圍內，中國公式的計算劑量能夠達到較高的準確度。若能夠獲得患者的詳細信息，建議優先使用中國公式與Warfarin Dosing計算，因相對于IWPC公式而言這兩種計算方法涵蓋的臨床因素更全面，能提供更精確的華法林推薦劑量。

中國公式仍存在一些不足，Warfarin Dosing網站與IWPC公式主要支持對20歲以上患者的劑量計算，而中國公式未明確提出年齡的要求。本研究中納入的19歲患者通過IWPC公式與Warfarin Dosing網站計算得到的劑量與中國公式的差值均超過了95%CI。目前，國際上已有研究者提出了基于歐洲兒童CYP2C9*2/*3與VKORC1-1639G>A基因型的華法林劑量計算方法[15]，但還沒有公認的基于大樣本研究驗證的可以較準確預測中國兒童華法林劑量的模型算法，這也是中國公式后期有待完善之處。

與傳統的給藥方案比較，基于基因型的劑量預測能夠在一定程度上縮短用藥初期反復調整華法林劑量的時間，但并不能完全保證可以改善患者預后。患者在整個抗凝治療過程中，生理、病理狀態處于一個動態變化的過程，其個體化華法林劑量的需求會隨著疾病狀態、合并用藥、飲食等種種原因發生改變；如過分相信基因檢測技術與劑量預測模型，而誤認為只要使用該計算劑量即定能獲得安全的治療，可能會對患者造成嚴重后果。因此在整個華法林用藥過程中應持續進行INR的監測與長期的藥學監護，在用藥過程中發現影響因素并反饋到預測模型中，不斷完善模型算法。

綜上所述，本地區漢族人群中存在CYP2C9 1075與VKORC1-1639位點的多態性，基因型以CYP2C9*1/*1 & VKORC1 AA型為主。建議患者服用華法林前先進行CYP2C9、VKORC1的基因多態性檢測，利用計算因素更全面的中國公式與Warfarin Dosing網站預測初始劑量，并在后期持續監測INR。