稽留流產與子宮蛻膜組織中PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA的相關性分析

龔凈嫻，劉 敏，楊 芳，田春艷，李 蓉

綿陽市中心醫院：1.產科；2.婦科，四川綿陽 621000；3.綿陽市第三人民醫院婦產科，四川綿陽 621000

稽留流產又稱為過期流產或死胎不下[1]，胚胎停止發育后2個月尚未自然排出者為稽留流產。陰道流血及腹痛是稽留流產的常見癥狀，同時患者可伴有先兆流產癥狀。先兆流產若不及時處理，不僅影響患者健康，而且可能會影響患者再次生育[2]。為此，早期診斷并采取針對性措施顯得尤為重要。目前，關于稽留流產的病因并無定論，可能與生活環境、內分泌水平、精神壓力、基因等因素有關[3]。隨著分子生物學技術的不斷發展，各種分子生物學指標的檢測為臨床疾病的診斷提供了新的方法。重組人妊娠特異性β1糖蛋白(PSG1)mRNA、重組人骨形態發生蛋白-2(BMP-2)、Beclin-1 mRNA是近年來研究較多的稽留流產相關指標。有研究報道，稽留流產患者子宮蛻膜組織中PSG1 mRNA、BMP-2水平顯著降低，而Beclin-1 mRNA水平顯著升高[4]。為此，筆者對比分析了稽留流產患者及健康人工流產者的一般資料及子宮蛻膜組織中PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平，旨在探討稽留流產的相關因素，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年6月綿陽市中心醫院收治的稽留流產患者50例作為觀察組，均符合第八版婦產科學稽留流產的診斷標準[5]。另外，選取同期因意外懷孕于綿陽市中心醫院行人工流產的健康女性50例作為對照組。排除標準：合并神經系統疾病者；有嚴重傳染性疾病者；長期服用免疫抑制劑者；合并盆腔腫瘤者；有急性上呼吸道感染者；物質濫用者。本研究經該院倫理委員會批準，患者及家屬均知情并同意本研究。

1.2方法

1.2.1資料與數據的記錄和比較 觀察并記錄兩組患者一般資料[包括性別、年齡、體質量指數(BMI)、卵泡刺激素(FSH)/黃體生成素(LH)、人工流產次數、自然流產次數、不孕時間)、PSG1 mRNA、BMP-2及Beclin-1 mRNA水平]。mRNA水平以相對表達量表示，BMP-2水平以表達分數表示，比較兩組間PSG1 mRNA、BMP-2及Beclin-1 mRNA水平差異。

1.2.2mRNA的檢測 兩組患者均進行人工流產術，術中取子宮蛻膜組織，經磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗血跡后，于-80 ℃冰箱中保存待檢。取子宮蛻膜組織20 mg，采用Magzol試劑結合過柱法提取總RNA，檢測總RNA純度、濃度及完整性，用Thermo Scientific RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒，以2 μg RNA作為模版進行反轉錄，得到cDNA。然后以cDNA為模板，以無RNA酶的DEPC水作陰性對照，待測樣品及陰性對照均設3個復孔進行檢測。采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測蛻膜組織中PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA水平。qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。PSG1上游引物序列為5′-TGCACACAGCGCATCAAA-3′，下游引物序列為5′-CTCCTCTAGTCCCATCATCTCC-3′；Beclin-1上游引物序列為5′-AACCAACGTCTTTAATGCAACCTTC-3′，下游引物序列為5′-AGCAGCATTAATCTCATTCCATTCC-3′；β-actin上游引物序列為5′-GCCGCCAGCTCACCAT-3′，下游引物序列為5′-AATCCTTCTGACCCATGCCC-3′。反應體系為10 μL。應用Bio-Rad qPCR儀進行PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA的檢測。PSG1 mRNA qPCR檢測的反應條件:95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共40 個循環；Beclin-1 mRNA qPCR檢測的反應條件:94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。記錄擴增曲線和熔解曲線，根據擴增曲線，得到每個樣本的循環閾值(Ct)值，采用2-ΔΔCt法計算PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA的相對表達量，重復3次檢測，取平均值。

1.2.3BMP-2的免疫組化檢測 (1)取蛻膜經生理鹽水漂洗后置于10%甲醛溶液中固定6～12 h后水洗10～20 min，經梯度酒精脫水后浸蠟、石蠟包埋，5 μm切片;(2)pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液中加熱至95 ℃ 15 min修復抗原，冷卻后至3%H2O2溶液中浸泡20 min，平衡鹽緩沖液(TBS)洗2次;(3)加一抗37 ℃孵育30 min后置于4 ℃冰箱過夜，TBS緩沖液洗2次;(4)加HRP二抗37 ℃孵育20 min，TBS緩沖液洗2次;(5)DAB顯色15 min，自來水沖洗、蘇木素復染、沖洗;(6)脫水干燥、透明、封片。BMP-2抗體均為兔多克隆抗體(試劑購自博奧森生物有限公司)。BMP-2表達分數判定標準：應用計算機輔助顯微圖像分析系統，每次隨機抽取5個高倍鏡視野進行觀察；以細胞內出現黃色顆粒為陽性細胞，無著色為陰性細胞；細胞染色強度從棕黃色、橘黃色、淡黃色染色至無著色依次減弱，分別計3、2、1、0分，同時按陽性細胞百分率計分:>75%計4分，>50%～75%計3分，>25%～50%計2分，5%～25%計1分，<5%計0分，染色分數和陽性細胞百分率計分相乘得到表達分數。

2 結 果

2.1兩組間PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平比較 觀察組PSG1 mRNA、BMP-2水平低于對照組(P<0.05)，Beclin-1 mRNA水平高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組間PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平的比較

2.2稽留流產單因素分析 年齡、BMI、FSH/LH、人工流產次數、自然流產次數、不孕時間、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與稽留流產具有相關性(P<0.05)，見表2。

表2 稽留流產的單因素分析[n(%),n=50]

2.3稽留流產的多因素Logistic回歸分析 經Logistic回歸分析，人工流產次數、自然流產次數、不孕時間、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與稽留流產具有相關性(P<0.05)，見表3。

表3 稽留流產的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

稽留流產不僅危害母體健康，而且死胎長期留在體內可能會影響下次妊娠及胚胎著床。為此，及時識別稽留流產并采取相應干預措施在稽留流產的防治中顯得尤為重要[6]。稽留流產的發生過程：早期妊娠囊胚著床后，絨毛滋養細胞侵入母體螺旋動脈，形成“滋養細胞栓”，閉合了螺旋動脈，限制母血流入，導致胎盤在低氧狀態中發育，最終導致流產。由于低氧狀態會提高滋養細胞的應激水平，介導細胞自噬的產生，子宮蛻膜組織中的胚胎相關因子水平也會受到顯著影響。

PSG1是孕期母體中發現的主要胎盤蛋白，胎盤合胞體滋養層是PSG1的主要來源。PSG1具有一定的免疫功能，能通過調節巨噬細胞的表達來增強胚胎的免疫功能。有研究發現，在胎兒缺血、缺氧等應激狀態時，PSG1的水平有明顯波動[7]。在保護胎兒的同時，PSG1對母體也有一定的免疫增強功能。骨形成蛋白(BMP)是一組具有類似結構的高度保守的功能蛋白，屬于轉化生長因子-β家族。BMP-2能刺激DNA的合成和復制，從而促進間充質細胞定向分化為成骨細胞。它還是體內誘導骨和軟骨形成的主要因子，并在肢體生長、軟骨內骨化、骨折早期、軟骨修復時表達，對骨骼的胚胎發育和再生修復起重要作用。在胚胎發育的早期，BMP-2表達水平較為穩定，當出現胎兒宮內窘迫時BMP-2水平受到顯著影響，呈下降趨勢[8]。有研究發現，稽留流產患者胎盤細胞自噬功能顯著增強，可能與胎盤細胞的自我保護有關，而其中自噬相關蛋白Beclin-1在這個過程中發揮著重要的作用[9-10]。

本研究中，觀察組患者PSG1 mRNA、BMP-2水平均低于對照組，觀察組Beclin-1 mRNA水平高于對照組，可能與稽留流產患者胎盤系統應激反應及自噬的激活有關[10-11]。單因素分析和多因素Logistic回歸分析顯示，人工流產次數、自然流產次數、不孕時間、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與稽留流產具有一定的相關性。有研究發現，首次流產患者子宮蛻膜組織PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與再次妊娠時子宮蛻膜組織上述指標的水平具有一定的相關性[12-14]，這意味著若首次妊娠時上述指標的水平異常則下次妊娠時這些指標水平異常風險會增加，這對于想再次妊娠的患者具有一定的意義。

綜上所述，人工流產次數、自然流產次數、不孕時間、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平與稽留流產具有一定的相關性，可為稽留流產的診斷提供參考。