DNA微陣列芯片法在海南地區(qū)結(jié)核病診斷及耐藥性檢測中的應用

馮所遠，陳灼霖，符史健，鐘業(yè)騰△

1.海口市第四人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，海南海口 571100；2.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科，海南海口 570311

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的一種嚴重危害人類健康的慢性傳染性疾病[1]。據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，我國結(jié)核病患者數(shù)量僅次于印度，占全球的9%；2018年全球約有48.4萬新發(fā)耐利福平結(jié)核病，我國占14%，遠超全球平均水平[2]。耐藥結(jié)核病疫情形勢嚴峻，全球結(jié)核病防控工作面臨挑戰(zhàn)[3]。早發(fā)現(xiàn)、早治療是減少結(jié)核發(fā)病及傳播的重要途徑[4]，但截至2015年年底，我國結(jié)核病的病原學檢出率僅為33%，明顯低于《“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃》中要求的50%[5]。這與臨床實驗室診斷技術(shù)水平滯后有關(guān)，當前各級醫(yī)療機構(gòu)主要使用的檢測方法是痰涂片與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)加藥敏試驗，前者雖價格低廉但靈敏度低，后者雖為診斷金標準但耗時過長，無法滿足臨床快速診斷的需求[6]，有可能造成MTB耐藥株的傳播。因此，當前控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵在于盡快建立早期快速診斷MTB感染及其耐藥性檢測的技術(shù)。WHO及我國先后把分子生物學診斷納入結(jié)核病診斷標準[7]。DNA微陣列芯片法(以下簡稱為“DNA芯片法”)是通過檢測標本中MTB及其相關(guān)耐藥基因的突變，從而判定是否感染MTB及其對利福平和異煙肼耐藥性的一種分子生物學診斷技術(shù)，可在6～8 h得到結(jié)核病診斷及耐藥性檢測結(jié)果。雖然國內(nèi)很多文獻報道了關(guān)于DNA芯片法在結(jié)核病診斷中的應用，但是應用大樣本量的痰標本直接評估DNA芯片法在MTB診斷和耐藥性檢測中的應用還很少[8-9]，且不同地區(qū)MTB耐藥基因突變位點也存在差異。本研究主要采用DNA芯片法對海南地區(qū)疑似結(jié)核病患者的痰標本進行了檢測，探討了DNA芯片法在海南地區(qū)結(jié)核病診斷及耐藥性檢測中的應用價值，同時分析海南地區(qū)MTB耐藥基因的特征。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年1月至2019年12月于海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院和海口市第四人民醫(yī)院就診2 069例疑似結(jié)核病患者納入研究。其中男性1 566例，年齡(53.3±16.2)歲；女性503例，年齡(50.3±18.0)歲。

1.2儀器與試劑 MTB DNA提取試劑、MTB耐藥基因檢測試劑盒(DNA芯片法)、核酸快速提取儀、芯片洗干儀、芯片雜交儀和微陣列芯片掃描儀等均購自北京博奧公司；酸性羅氏培養(yǎng)基、比例法藥敏試驗相關(guān)試劑、硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基和抗酸染色液均購自珠海貝索公司；BSC-1600ⅡB2型生物安全柜購自蘇州安泰公司。MTB H37Rv(ATCC27294)標準株由中國疾病預防控制中心結(jié)核病參比實驗室提供。

1.3方法

1.3.1標本預處理和抗酸桿菌涂片染色 每例患者分別留取隨機、晚上及早上3份痰標本，每份痰標本至少2 mL；檢測時，吸取每例患者的2份質(zhì)量較好的痰標本各1 mL進行混合，共得到2 069份痰標本。痰標本按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[1]要求進行涂片抗酸染色鏡檢。再加入1～2倍體積的4% NaOH溶液，然后振蕩混勻，室溫靜止15 min，制成預處理痰標本。

1.3.2MTB的分離培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗 按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[1]要求進行試驗，預處理痰標本采用羅氏培養(yǎng)法進行分離培養(yǎng)；培養(yǎng)陽性的菌株采用PNB/TCH培養(yǎng)基進行初步菌種鑒定；采用WHO推薦的比例法對利福平(40 μg/mL)和異煙肼(0.2 μg/mL)進行MTB的藥敏試驗。

1.3.3DNA芯片法 吸取1 mL預處理痰標本上清液于1.5 mL微量離心管中，按照MTB耐藥基因檢測試劑盒使用說明書操作，制備成核酸提取物。吸取所得核酸提取物2 μL依次加入到3個分別預先分裝好18 μL PCR擴增試劑的1、2、3號PCR管中，放入基因擴增儀中進行擴增，所得到PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后嚴格按照試劑盒說明書要求進行PCR產(chǎn)物點樣、雜交及芯片洗干、芯片掃描分析，在晶芯MTB藥敏檢測分析系統(tǒng)進行信號分析及結(jié)果判斷。

1.4質(zhì)量控制 涂片陽性標本中培養(yǎng)陽性(涂陽培陽)率不低于90%，培養(yǎng)污染率應小于5%；海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院結(jié)核病實驗室每年參加中國疾病預防控制中心結(jié)核病參比實驗室和結(jié)核病防治臨床中心的抗酸桿菌涂片檢查、分枝桿菌分離培養(yǎng)、抗結(jié)核藥敏試驗及結(jié)核病分子技術(shù)室間質(zhì)量評價活動。

1.5統(tǒng)計學處理 用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用配對四方格χ2檢驗評估兩種方法的差異性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；兩種方法檢測結(jié)果的一致性檢驗用Kappa檢驗判別，當Kappa≥0.75，一致性較好；當Kappa為0.4～<0.75，一致性一般；當Kappa<0.4，一致性較差[10]。

2 結(jié) 果

2.1痰標本的檢測情況 在2 069份痰標本中，抗酸桿菌涂片陽性率為30.3%(626/2 069)；分離培養(yǎng)陽性率為45.6%(944/2 069)，涂陽培陽率為90.7%(568/626)，污染率為0.2%(4/2 069)；符合痰培養(yǎng)質(zhì)控要求。所有痰標本分別經(jīng)PNB/TCH培養(yǎng)基鑒定和DNA芯片法菌種基因鑒定共檢測出1 054份單獨MTB感染、131份單獨非結(jié)核分枝桿菌(NTM)和7份MTB+NTM混合感染的痰標本。剔除131份單獨NTM感染、7份MTB+NTM混合感染、4份培養(yǎng)污染和8份DNA芯片法檢測信號異常痰標本，共有1 919份痰標本納入本研究分析。

2.2DNA芯片法與兩種傳統(tǒng)方法檢測MTB的比較 在納入研究分析的1 919份痰標本中，采用DNA芯片法、羅氏培養(yǎng)法和抗酸桿菌涂片法檢測MTB的陽性率分別為46.9%(900/1 919)、42.4%(814/1 919)和29.5%(567/1 919)。DNA芯片法分別與羅氏培養(yǎng)法比較、抗酸桿菌涂片法比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 DNA芯片法與兩種傳統(tǒng)方法檢測MTB的比較

2.3DNA芯片法與比例法檢測MTB耐藥性的比較

2.3.1DNA芯片法與比例法檢測MTB耐藥性的比較 對720份DNA芯片法與羅氏培養(yǎng)法同為陽性的痰標本采用DNA芯片法和比例法進行MTB的耐藥性檢測，以比例法為金標準。DNA芯片法與比例法檢測MTB對耐利福平、異煙肼的耐藥性的結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但均具有較好一致性(Kappa≥0.75)，見表2。

表2 DNA芯片法與比例法檢測MTB耐藥性的比較

2.3.2兩種方法檢測MTB多重耐藥(MDR)的結(jié)果比較 DNA芯片法與比例法檢測多重耐藥結(jié)核(MDR-TB)的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但具有較好一致性(Kappa=0.778)，以比例法為金標準，靈敏度為76.41%，特異度為97.33%，符合率為91.67%。見表3。

表3 DNA芯片法與比例法檢測MDR-TB的比較分析

2.4DNA芯片法檢測MTB耐藥基因突變位點 耐利福平突變菌株主要基因突變位點為rpoB531，占58.2%(156/268)；其中主要突變類型為C→T，占56.3%(151/268)。耐異煙肼突變菌株主要基因突變位點為KatG315，占89.7%(175/195)；其中主要突變類型為G→C,占84.6%(165/195)。MDR-TB耐藥基因突變位點主要為rpoB531+KatG315，占54.6%(89/163)。見表4、5。

表4 DNA芯片法檢測MTB耐藥基因突變位點分布情況

續(xù)表4 DNA芯片法檢測MTB耐藥基因突變位點分布情況

表5 DNA芯片法檢測MDR-TB的耐藥基因突變位點分布情況

3 討 論

歷年的海南地區(qū)流行病學調(diào)查顯示，該地區(qū)結(jié)核病患者數(shù)量一直處于全國前列[11-12]，這主要跟當?shù)氐臍v史、經(jīng)濟、文化有關(guān)，該地區(qū)臨床實驗室篩查結(jié)核病的方法主要還是痰涂片與傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏試驗，這已無法滿足結(jié)核病診斷和治療的需求。DNA芯片法作為一種分子生物學診斷技術(shù)，近年來在我國已廣泛地應用于結(jié)核病的診斷和治療，有相關(guān)文獻報道DNA芯片法檢測MTB有較高的特異度和靈敏度[13]。本研究采用DNA芯片法直接檢測痰標本中MTB及其相關(guān)耐藥基因，這縮短了MTB診斷及其耐藥性檢測的時間。本研究對1 919份痰標本的分析發(fā)現(xiàn)，DNA芯片法檢測MTB的陽性率為46.9%，明顯高于趙靜等[14]的報道，其檢測MTB的陽性率明顯高于羅氏培養(yǎng)法和抗酸桿菌涂片法，這表明DNA芯片法在結(jié)核病患者痰標本MTB的診斷中有較高的應用價值，有助于提高MTB的檢出率。

本研究發(fā)現(xiàn)，以比例法為金標準，DNA芯片法檢測耐利福平、異煙肼MTB及MDR-TB的特異度分別為93.29%、97.73%、97.33%，靈敏度分別為97.12%、77.97%和76.41%，符合率為94.58%、91.25%、91.67%，其中耐利福平、異煙肼MTB及MDR-TB檢測的特異度和符合率與趙冰等[15]、陳林等[16]的報道相近，但耐利福平MTB檢測的靈敏度明顯高于文獻報道，而耐異煙肼MTB及MDR-TB檢測靈敏度則均低于文獻報道，這可能是海南地區(qū)的MTB耐利福平及異煙肼相關(guān)基因突變特征與文獻所報道地區(qū)不同有關(guān)，也可能與本研究為大樣本量研究有關(guān)。本研究中，DNA芯片法對痰標本MTB的耐利福平基因檢測靈敏度比耐異煙肼和MDR-TB效果好，這可能是因為本研究所使用的DNA芯片檢測試劑盒所能檢測的耐異煙肼基因突變位點不夠全面，未能覆蓋海南地區(qū)MTB常見的耐異煙肼基因突變位點。有文獻報道，耐利福平MTB有95%以上是由rpoB基因突變所致[17-18]；耐異煙肼MTB耐藥株主要是由KatG(占45%～75%)和inhA(占15%～25%)基因突變引起的，但還存在一定比例耐異煙肼MTB是由ahpC和KasA等基因突變引起[19]；海南地區(qū)部分耐異煙肼MTB可能存在其他耐藥機制；不能排除痰標本中有多種耐藥類型的MTB耐藥株存在。而MDR-TB檢測效果較差也是受異煙肼耐藥株檢測效果影響所致。這說明DNA芯片法在結(jié)核病耐藥性檢測中還存在一定局限性，不能完全取代傳統(tǒng)藥敏試驗，但作為WHO推薦用于MDR-TB的快速分子診斷方法，本研究也發(fā)現(xiàn)了其在海南地區(qū)疑似結(jié)核病患者的痰標本MTB利福平、異煙肼耐藥性及MDR-TB檢測中均有較高特異度和靈敏度，是可以應用于海南地區(qū)臨床實驗室對耐藥結(jié)核的診斷或篩查。

本研究發(fā)現(xiàn)，海南地區(qū)MTB耐利福平基因突變類型主要是rpoB531(C→T)，而耐異煙肼基因突變類型主要是KatG315(G→C)，MDR-TB耐藥基因突變類型主要為rpoB531+KatG315，與許榕青等[20]的報道相近，明顯高于王丹吉等[9]的報道，這表明MTB相關(guān)耐藥基因突變導致的耐藥存在一定的地域差異，也說明海南地區(qū)的MTB耐利福平基因突變主要與rpoB上531密碼子突變有關(guān)，耐異煙肼基因突變主要與KatG上315密碼子發(fā)生突變有關(guān)，但也應注意有一定比例MTB耐藥株是inhA基因啟動子突變引起的對異煙肼的低水平耐藥。

本研究還從2 069份痰標本中發(fā)現(xiàn)131份單獨NTM感染和7份為NTM+MTB混合感染的患者，這顯示海南地區(qū)在防控結(jié)核病疫情中應注意鑒別NTM感染和NTM+MTB混合感染，在進行傳統(tǒng)抗酸桿菌涂片和羅氏培養(yǎng)時，容易受NTM干擾，無法鑒別是否存在MTB感染，且NTM對PNB/TCH和常用抗結(jié)核藥物具有高耐藥性的特征，容易引起臨床誤診、誤治[6]，而DNA芯片法可直接檢測患者標本中的MTB及其相關(guān)耐藥基因，可有效避免標本中NTM的干擾，可更快速、準確地對MTB及其相關(guān)耐藥基因進行檢測。

綜上所述，DNA芯片法在MTB檢測中具有快速、準確的特點，對臨床及時、準確地進行抗結(jié)核治療具有重要意義。