TBX2亞家族基因在非小細胞肺癌中的表達及其與預后的關系

米 瑞，季 源，曹 燁，任 靜，邵 赟，浦尋藝，許傳先，劉 藝，胡志剛△

1.江蘇省無錫市兒童醫院/南京醫科大學附屬無錫兒童醫院檢驗科，江蘇無錫 214023;2.蘇州大學醫學院，江蘇蘇州 215123

肺癌已成為全球癌癥相關死亡的主要原因[1]。隨著全世界范圍內的城市化、工業化和環境污染加劇，肺癌的病因也變得更加復雜、多樣。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的85%，依據WHO肺癌分類標準，NSCLC又分為鱗狀細胞癌(以下簡稱“鱗癌”)、腺癌和大細胞肺癌[2]。在全球范圍內肺癌的發病率逐年增高，放化療在預防腫瘤進展方面的效果有限，因此，確定其預后標志物和相關風險因素對于提高肺癌患者生存率和改善預后具有重要意義。

T-box基因家族是一組高等動物轉錄因子家族(TFs)基因，它們都包含一個高度保守的序列特異性DNA結合區域(T-box)，TBX2亞家族是T-box家族的重要成員[3]。TBX2亞家族分類依據主要是序列同源性和表達模式，其成員包括TBX2、TBX3、TBX4、TBX5[4]。該亞家族基因兩兩相互作用(TBX2-TBX3、TBX4-TBX5)在肢體的形成和心臟發育中的作用已得到廣泛的研究[5]。TBX2被證實在乳腺癌組織和細胞系中過度表達，同時高表達的TBX2與乳腺癌的預后不良高度相關[6]。有研究表明，TBX3的過度表達可通過影響細胞的衰老和凋亡，促進細胞的增殖、腫瘤的形成和侵襲過程等多種途徑來參與腫瘤的發展進程[7]。KHALIL等[8]的轉錄組學相關研究發現TBX4、TBX5在肺腺癌中具有腫瘤抑制因子的作用。

本研究利用生物信息學和免疫組織化學的方法分析TBX2亞家族基因在NSCLC中的表達情況及其與預后的關系。采用生物信息學網站在線分析的手法，分析TBX2亞家族基因啟動子區域的甲基化程度，初步探討TBX2亞家族基因參與腫瘤發生、發展的表觀遺傳學機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所使用的52例肺鱗癌組織及其配對癌旁組織均來源于南京醫科大學附屬無錫人民醫院病理科。本研究經南京醫科大學附屬無錫人民醫院倫理委員會批準，而且患者本人知情同意。所有的肺鱗癌組織均通過手術取材，冷凍后轉移至病理科。本研究中的所有組織標本均由兩名病理科醫師進行HE染色確證為肺鱗癌組織。所有免疫組織化學染色的結果均由兩名病理科醫師在雙盲條件下進行評估，并對全片進行掃描和圖像采集。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析 基于HUGO基因命名委員會的基因分類情況(http://www.genenames.org/cgi-bin/genefamilies/set/766)[9]，檢索出TBX2亞家族基因信息，其中包括TBX2、TBX3、TBX4、TBX5 4個成員。利用TBX2/homo、TBX3/homo、TBX4/homo、TBX5/homo等檢索詞，于美國國家生物信息中心(NCBI)基因數據庫中檢索TBX2亞家族基因的基因信息。應用軟件繪制出該家族成員的轉錄產物結構，包括其非翻譯區、編碼序列(外顯子)和其他的一些功能結構域，依據2019年9月NCBI數據庫的數據進行對比。Oncomine(網址為www.oncomine.org)是一個在線分析腫瘤基因芯片的數據庫[10]，應用Oncomine數據庫分析TBX2亞家族基因在不同癌組織及正常組織中的mRNA水平差異。通過基因表達譜動態分析在線網站(GEPIA)[11]分析TCGA和GTEx數據庫中TBX2亞家族基因在肺腺癌和肺鱗癌中的表達情況。利用Kaplan-Meier Plotter數據庫(網址為http://kmplot.com/analysis)[12]的肺癌數據集對TBX2亞家族基因進行在線生存分析。利用MethHC數據庫(網址為http://MethHC.mbc.nctu.edu.tw)[13]對肺癌組織與正常組織中TBX2亞家族基因啟動子區域的甲基化程度進行分析。

1.2.2HE染色 首先將組織切片在70 ℃環境下烘烤4 h，脫蠟，在蒸餾水中保濕，用蘇木精染色1 min，鹽酸乙醇分化數秒，流水沖洗，在返藍液中返藍，伊紅染料中復染，在不同濃度的乙醇中脫水，用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中進行透明，最后用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察組織切片。

1.2.3免疫組織化學染色 肺癌組織切片脫蠟，水化，然后浸入含0.3%過氧化氫的甲醇中30 min。在PBS中清洗3次(每次3 min)，在1%的封閉血清中封閉30 min，隨后在抗TBX2、TBX3、TBX4、TBX5的多克隆抗體中孵育過夜。在PBS中清洗3次，將載玻片于生物素化的羊抗鼠IgG孵育15min,然后再次用PBS洗滌3次。最后，用DAB孵育10 min，觀察過氧化物酶的反應。TBX2亞家族基因TBX2、TBX3、TBX5的抗體購自Abcam公司,TBX4的抗體購自Invitrogen公司。結果判定：TBX2亞家族基因的陽性表達位于細胞質和細胞核，呈現淡黃色、黃色或棕黃色。遵循隨機化原則，在200倍的顯微鏡下隨機捕獲10個區域和3個代表區域，進行陽性程度的大體評估。通過兩位病理科醫師鏡下大體評估結果來判斷TBX2亞家族基因在肺鱗癌中的表達情況。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行數據處理；計數資料以百分率或頻數表示，組間比較采用χ2檢驗；采用在線Kaplan-Meier曲線繪圖工具和logrank檢驗分析NSCLC患者TBX2亞家族基因的mRNA表達水平與生存率的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1基于Oncomine的TBX2亞家族基因在肺癌組織中的轉錄水平分析 TBX2在11個肺癌數據子集中的表達較正常肺組織降低；TBX3在Oncomine的7個肺癌子集中存在表達降低的現象。TBX4在3個肺癌子集中表達降低。見表1。

表1 基于Oncomine的TBX2亞家族基因在不同類型肺癌中的轉錄水平分析

2.2基于GEPIA的TBX2亞家族在肺鱗癌和肺腺癌中的mRNA水平分析及其與肺癌分期的關系 采用GEPIA分析了來自TCGA和GTEx數據庫的347例正常肺組織標本和483例肺腺癌標本；同時也分析了來自TCGA和GTEx數據庫的338例正常肺組織標本和486例肺鱗癌標本；與正常肺組織比較，TBX2亞家族基因mRNA水平在肺腺癌組織中均降低(P<0.05)；同樣地，在肺鱗癌組織中的mRNA水平也均降低(P<0.05)，見圖1。依據TCGA和GTEx數據庫提供的肺癌分期信息，對TBX2亞家族基因在肺腺癌和鱗癌中的mRNA水平和肺癌分期情況生成小提琴圖，見圖2；TBX2、TBX3、TBX5的mRNA水平與肺癌分期無相關性(P>0.05)，但TBX4的mRNA水平與肺癌分期具有相關性(P<0.05)。

注：*表示與正常肺組織比較，P<0.05； 淺色柱狀圖表示癌組織，深色柱狀圖表示正常肺組織。

圖2 TBX2亞家族基因mRNA水平與NSCLC分期的關系

2.3TBX2亞家族基因mRNA水平與NSCLC患者預后的關系 2 435例NSCLC患者中，Kaplan-Meier生存曲線和logrank檢驗分析表明，TBX2亞家族所有成員的mRNA水平降低均與NSCLC患者的總生存率具有相關性(P<0.05)；其中，TBX3低表達與NSCLC患者無進展生存率相關(P<0.05)；TBX5低表達與NSCLC患者的無進展生存率和進展后生存率均具有相關性(P<0.05)，見圖3。

2.4免疫組織化學驗證TBX2亞家族基因在肺癌中的低表達現象 為了進一步驗證上述生物信息學分析結果，本課題組在臨床上收集了52例肺鱗癌組織標本及其配對癌旁正常肺組織進行免疫組織化學染色，分析TBX2亞家族基因在肺鱗癌中的表達情況。對肺鱗癌組織及其配對的正常組織進行了HE染色，驗證了其癌癥的類型及惡性程度。然后，對收集的肺癌組織標本進行了免疫組織化學染色，見圖4。與配對的正常肺組織相比，肺鱗癌組織中的TBX2、TBX3、TBX4、TBX5的表達均降低(P<0.05)，見表2。

表2 TBX2亞家族基因在肺鱗癌組織及配對正常肺組織中的陽性表達率分析[n=52,n(%)]

2.5TBX2亞家族基因之間的共表達情況 采用Oncomine對肺癌標本的TBX2亞家族基因共表達情況進行了分析，發現TBX5與TBX2、TBX3存在共表達現象。除此之外，使用GEPIA進行TBX2亞家族基因共表達情況的分析，在肺腺癌和肺鱗癌的標本中TBX2與TBX4的表達水平相關(r=0.50,P<0.05)，TBX2與TBX5的表達水平相關(r=0.48,P<0.05)，TBX4與TBX5的表達水平相關(r=0.63,P<0.05)，見圖5。兩個數據庫的綜合分析表明，TBX2與TBX5具有共表達的現象。

圖5 GEPIA中TBX2亞家族基因的共表達情況分析

2.6肺腺癌和肺鱗癌中TBX2亞家族基因啟動子區域的甲基化程度 利用MethHC網站對TBX2亞家族基因在肺腺癌和肺鱗癌中的低表達現象與該家族基因啟動子區域甲基化的相關性進行分析。肺腺癌組織與正常組織比較，TBX2基因啟動子區域的甲基化程度增高(P<0.05)；但肺鱗癌組織與正常組織比較，該區域的甲基化程度差異無統計學意義(P>0.05)。TBX3、TBX4、TBX5基因無論是在肺腺癌還是肺鱗癌組織中，與正常組織相比，其啟動子區域的甲基化程度都增高(P<0.05)。

3 討 論

TBX2亞家族基因已被報道與人類多種疾病有關[14]，其在癌變過程中的作用也被進一步確認[15]，但TBX2亞家族基因在肺癌發生和預后中的作用仍不清楚。本研究的結果顯示，TBX2亞家族基因的低表達與NSCLC患者的預后不良具有相關性；通過免疫組織化學的方法，驗證了TBX2亞家族基因在肺癌中的低表達現象；同時，利用生物信息學的手段發現TBX2亞家族基因的在NSCLC中的低表達現象可能與其對應啟動子區域的甲基化程度增高密切相關。

早期的研究發現，TBX2在乳腺癌、膀胱癌等癌癥中高表達[6,16]。TBX2可通過招募一系列抑制復合物與EGR1反應性啟動子結合，從而導致乳腺癌細胞不受控制地增殖[17]。與之不同的是，在本研究中，TBX2的表達模式與乳腺癌和膀胱癌恰恰相反。Oncomine和GEPIA的數據分析以及免疫組織化學染色的結果都表明，TBX2在NSCLC患者體內表達顯著下調。本研究證實，TBX2亞家族基因在NSCLC中的低表達模式，與其亞家族基因啟動子區域的高度甲基化密切相關。但目前的沒有證據證實TBX2與NSCLC的分期相關。TBX3在大多數人類惡性腫瘤如黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌和膀胱癌中都存在過表達的現象，TBX3的高表達通常提示著腫瘤的轉移和預后不良，其機制為TBX3抑制E-cadherin的表達從而促進了腫瘤的侵襲[18]。與之不同的是，本研究Oncomine、GEPIA以及免疫組織化學的分析結果都表明TBX2在NSCLC中呈現低表達模式。TBX3與NSCLC患者的預后具有相關性，TBX3低表達是NSCLC患者總生存率降低的獨立影響因素。研究發現，TBX4的低表達是2期胰腺導管癌患者總生存率的獨立預后因素,TBX4的低表達提示2期胰腺導管癌患者預后較差[19]。一項關于肺成纖維細胞的轉錄組測序表明，肺癌相關的成纖維細胞TBX4表達下調且啟動子區域高度甲基化，提示TBX4的表觀遺傳沉默與肺癌成纖維細胞表型改變有關[20]。與HORIE等[20]的研究結果相似，本研究表明，與正常組織相比，TBX4在NSCLC患者組織中表達降低；TBX4的低表達與肺癌患者的低生存率具有相關性。TBX4的表達在不同分期的NSCLC間差異顯著，這與其在胰腺導管癌中的作用相一致。早期的研究表明，TBX5在哺乳動物的前肢和心臟發育中發揮重要作用，然而關于其在腫瘤進程中作用仍有待闡明[21-22]。ROSENBLUH等[23]的報道指出，在結腸癌的發生發展過程中TBX5與β-catenin和Yes相關蛋白1(YAP1)形成的復合物是腫瘤細胞生存所必需的，其他的腫瘤中也有類似的現象。在胃癌患者中，TBX5已被驗證其高表達與1期和2期胃癌患者的總生存率降低相關[24]。本研究發現，TBX5同樣在NSCLC的癌組織中呈現表達降低的趨勢，更為重要的發現是低表達的TBX5與肺癌患者的低總生存率、無進展生存率、進展后生存率均有相關性。共表達分析的結果表明，TBX2與TBX5具有共表達的現象。

綜上所述，4個TBX2亞家族基因在NSCLC患者組織中均呈現低表達模式,TBX2亞家族基因在NSCLC中的低表達現象是NSCLC預后不良的因素。該低表達模式可能與NSCLC患者該家族基因啟動子區域的高度甲基化密切相關。