多重熒光定量PCR法快速鑒定MRSA的臨床研究

趙峻英，席家莊，謝鈮奇，潘莉娟，王 杉，董 劍

重慶市大足區人民醫院檢驗科，重慶 402360

金黃色葡萄球菌(SA)廣泛存在于自然界中，是革蘭陽性菌的代表，也是人類的一種重要病原菌，可引起嚴重的感染性疾病。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是SA中的獨特菌株，對所有青霉素和幾乎所有β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，甚至可能對四環素類、氨基糖苷類、大環內酯類等抗菌藥物多重耐藥，是引起院內和社區感染的重要病原菌之一，嚴重威脅人類的健康，成為當今感染醫學中的一個難題[1]。因此，高效、靈敏、準確的MRSA檢測手段，對于MRSA的早期診斷和精準治療，以及有效預防和控制MRSA傳播至關重要。本研究擬建立單管多通道的Taqman探針熒光定量PCR檢測法，直接檢測患者標本或臨床培養的菌株中的nuc基因及mecA基因，并與傳統細菌培養和鑒定方法進行比較，以評估多重熒光定量PCR檢測法在快速鑒定MRSA中的應用價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1標本及菌株來源 收集2019年1-12月于本院就診的疑似MRSA感染的患者送檢標本共169例，其中痰液55例(32.54%)、尿液10例(5.92%)、膿液43例(25.44%)、分泌物46例(27.22%)、血液5例(2.96%)、灌洗液4例(2.37%)、棉拭子6例(3.55%)。菌株為隨機抽取的本院2014年10月至2019年10月保存的SA共156株，均經全自動細菌鑒定儀鑒定，其中MRSA 106株(67.95%)，甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)50株(32.05%)。

1.2儀器與試劑 VITEK2 Compact全自動細菌鑒定分析系統及配套細菌鑒定卡、5%CO2恒溫培養箱，鄭州安圖生物工程股份有限公司的哥倫比亞血平板、麥康凱、巧克力及其他平板，英國Oxoid公司的K-B法藥敏紙片，SA質控標準菌株(ATCC25923、ATCC29213)購自重慶市臨床檢驗中心。SLAN-96P型實時熒光定量PCR擴增儀購自上海宏石公司，細菌核酸提取試劑盒由重慶中元匯吉生物技術有限公司提供，三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)、Champagne Taq DNA多聚酶由北京天根生物科技有限公司生產，PCR引物及Taqman熒光探針由上海捷瑞生物公司合成。

1.3方法

1.3.1常規細菌鑒定及藥敏試驗 嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程(第4版)》對臨床送檢的169例標本進行常規細菌培養、鑒定及藥敏試驗(以下簡稱為“常規方法”),采用VITEK2 Compact全自動細菌鑒定分析系統及配套細菌鑒定卡。

1.3.2引物及Taqman探針的設計 從NCBI網站獲取基因序列，使用Bioedit軟件進行序列比對，根據比對結果選擇保守區域，使用Primer premier 5.0和Beacon Designer 7.0軟件進行PCR引物和Taqman探針設計，探針5′端分別標記Cy5、FAM和VIC，3′端標記MGB，見表1。

1.3.3核酸的提取 (1)臨床標本的處理。相對不濃稠的臨床標本(尿液、灌洗液、血液、分泌物等)，取1 mL于1.5 mL離心管中；相對濃稠的標本(痰液、膿液等)，先用等體積4%NaOH進行液化后取1 mL于1.5 mL離心管中；棉拭子標本，加入1 mL生理鹽水震蕩5 min后將液體倒入對應的1.5 mL離心管中；以3 000 r/min離心2 min后，棄900 μL上清液，加入100 μL混勻后的前處理液，蓋上離心管蓋，渦旋振蕩10 s，瞬時離心；90 ℃恒溫浴5 min。(2)菌株標本的處理。挑取2～3個菌落或適量菌株標本置于200 μL含細菌前處理液的離心管內；振蕩混勻后置于90 ℃恒溫浴5 min。進行核酸提取之前每管添加2 μL內控質粒，按照細菌核酸提取試劑盒說明書使用半自動提取儀進行核酸的提取。提取過程設置未加入標本的陰性對照及加入陽性質粒的陽性對照。

1.3.4PCR反應體系及條件 取24 μL DNA反應液、1 μL引物探針混合物于1.5 mL離心管中，震蕩混勻后，加入25 μL核酸提取物、陰性對照或陽性對照，總反應體系為50 μL。PCR反應條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，循環45次；收集并檢測熒光。熒光通道檢測選用FAM、VIC和Cy5通道。FAM通道對應mecA基因，Cy5通道對應nuc基因，VIC通道對應內標基因。

1.3.5結果判斷 VITEK2 Compact全自動細菌鑒定儀GP卡鑒定為SA，若AST-GP67卡頭孢西丁篩選試驗也呈陽性，即判定為MRSA。多重熒光定量PCR檢測結果中，nuc基因和mecA基因陽性則判定為MRSA，nuc基因陽性而mecA基因陰性則判定為MSSA，nuc基因陰性則判定為非SA。

1.4統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件進行統計分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩種方法對臨床標本的檢測結果比較 169例臨床標本中，常規方法檢出MRSA 48例，檢出率為28.40%(48/169)；多重熒光定量PCR檢出MRSA 53例，檢出率為31.36%(53/169)；兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。兩種方法檢測結果一致的共164例，其中MSSA 64例，MRSA 48例，非SA 52例；兩種方法檢測結果不一致的為5例，均為PCR基因檢測為MRSA，而常規方法未鑒定出MRSA。見表2。

表2 兩種方法對169例臨床標本的檢測結果(n)

2.2兩種方法對SA的檢測結果比較 156株SA中，常規方法鑒定出MRSA 106株、MSSA 50株，MRSA檢出率為67.95%(106/156)。多重熒光定量PCR鑒定出MRSA 108株、MSSA 48株，MRSA檢出率為69.23%(108/156)。兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。兩種方法結果一致的有154例，其中MRSA 106例、MSSA 48例；兩種方法結果不一致的有2例，均為多重熒光定量PCR檢測為MRSA而常規方法檢測為MSSA。見表3。

表3 兩種方法對156株SA的鑒定結果(n)

3 討 論

臨床抗菌藥物的不合理使用，加速了SA向MRSA的轉變。目前，MRSA已經成為引起全球院內感染的重要致病菌之一[2]。因此，研究針對MRSA快速且特異的檢測方法勢在必行。許多研究證明，MRSA的耐藥性主要由mecA基因介導[3-4],其轉錄產物青霉素結合蛋白2a(PBP2a)使菌株對β-內酰胺酶的結合力明顯降低，導致其對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，故SA一旦獲得mecA基因，便可表現為高度和多重耐藥，美國臨床實驗室標準化委員會建議，凡檢出mecA基因的SA即可判定為MRSA[5]。nuc基因編碼SA的耐熱核酸酶，在不同菌株之間有著較高的保守性，是SA的標志性基因。本研究針對SA的特異性基因nuc基因和MRSA的特異性基因mecA基因以及內標基因設計特異性引物和Taqman熒光探針，通過體系優化使三基因能夠同時在1個PCR管中進行擴增，通過擴增曲線即可判讀實驗結果，可同時快速鑒定MRSA或MSSA。

對臨床標本的檢測中，常規方法和多重熒光定量PCR對MRSA的檢出率比較，差異無統計學意義，但仍有5例標本兩種方法的檢測結果不符合，其中3例為痰液標本，2例為棉拭子標本。將接種這5例臨床標本的平板取出仔細觀察菌落的生長情況，發現在此3例痰液標本的血平板1區有1～3個溶血菌落生長，而平板的其他區域均為非溶血的其他優勢菌落。2例棉拭子標本均為鼻咽拭子，在它們的血平板1區和2區雖有較多溶血菌落生長，但整個平板更多的是其他非溶血菌落的生長。SA是鼻咽部常見的定植菌，臨床治療中更多地是希望從平板培養結果中獲取其他致病菌的信息。對于PCR基因檢測技術而言，只要標本中存在微量的nuc和mecA基因即可檢測出。

對SA的檢測中，對于常規方法鑒定出的106株MRSA，多重熒光定量PCR也均檢測到nuc基因和mecA基因，二者對MRSA檢出率的差異無統計學意義。兩種方法檢測結果不一致的2株，均為多重熒光定量PCR檢測為MRSA，而常規方法鑒定為MSSA。對此2株菌株重新轉種培養后分別再次用上述兩種方法進行鑒定，結果和之前一樣。這2株SA可能是含有mecA基因的隱匿型MRSA菌株，如果以PCR技術作為MRSA鑒定的“金標準”，常規方法MRSA鑒定的正確率為98.15%(106/108)。

多重熒光定量PCR檢測具有便捷、快速的優點，不僅可以直接檢測臨床標本，也可以檢測臨床分離的菌株，整個過程僅需1～2 h，與常規方法相比時間大大縮短；nuc基因、mecA基因及內控基因3種基因能夠同時在1個PCR管中進行擴增，通過擴增曲線可判定MRSA、MSSA和非SA；本研究體系只能檢測含mecA基因的MRSA，對與MRSA耐藥機制有關的其他基因，如mecC基因[6]，無法檢出；能同時檢測標本中微量的nuc和mecA基因，可發現隱匿型菌株的存在，減少漏檢風險，但無法區分MRSA或MSSA是感染還是定植菌。

雖然MRSA是感染菌還是定植菌需要通過常規細菌培養以及和臨床醫生溝通后才能判斷，對mecA基因以外的其他耐藥基因的檢測也需后續研究，但本研究建立的多重熒光定量PCR檢測法相對于常規方法能更簡便、快速、高靈敏、高特異地鑒定臨床標本和菌株中的MRSA，提高了MRSA的檢出率，減少了漏檢風險，對早期院內感染的防控和臨床抗菌藥物的合理使用具有重要價值。