巴爾通體MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)的建立與鑒定方法的評(píng)價(jià)

栗冬梅，徐愛(ài)玲，杜小莉，宋秀平，崔志剛，劉起勇

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所/傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206

巴爾通體是一群寄生于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)要求苛刻、革蘭染色陰性需氧桿菌，其宿主范圍廣泛、全球分布，部分種類(lèi)對(duì)人和動(dòng)物具有致病性，分類(lèi)學(xué)上屬于α-變形菌綱、根瘤菌目、巴爾通體科。目前有37種(包括亞種)巴爾通體被正式命名，與其近源的致病菌有引起人布魯氏菌病的布魯氏菌和植物致病菌根癌土壤桿菌。巴爾通體侵襲哺乳動(dòng)物，在其體內(nèi)復(fù)制繁殖，可持續(xù)感染紅細(xì)胞形成菌血癥，通過(guò)動(dòng)物間打斗、抓咬行為或者吸血節(jié)肢動(dòng)物在宿主與宿主、宿主與人之間傳播[1]，引起貓抓病、戰(zhàn)壕熱、心內(nèi)膜炎和卡瑞恩病等多系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣。巴爾通體是苛養(yǎng)菌，生長(zhǎng)緩慢，生化反應(yīng)不活潑、沒(méi)有特征性的菌落形態(tài)和染色鑒定方法，只能依靠DNA序列進(jìn)行分類(lèi)鑒定，增加了實(shí)驗(yàn)室操作難度，使得診斷更為困難[2-3]。

質(zhì)譜技術(shù)是20世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的生物大分子分析技術(shù)，主要用于蛋白質(zhì)、肽分子鑒定。近年，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)已廣泛應(yīng)用于革蘭陰性/陽(yáng)性菌、需氧/厭氧菌以及分枝桿菌、酵母菌和真菌的鑒定，成為微生物鑒定最成功的生物技術(shù)之一[4-5]。不同種屬微生物各自具有特定的蛋白質(zhì)組成，經(jīng)MALDI-TOF MS檢測(cè)可以獲得不同強(qiáng)度的質(zhì)荷比(m/z)，形成肽/蛋白指紋質(zhì)譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)中的圖譜進(jìn)行比對(duì)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的種屬鑒定。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單方便，鑒定準(zhǔn)確快速，高通量和低成本也是其主要優(yōu)勢(shì)，除了可鑒定常見(jiàn)細(xì)菌和真菌，還極大地提高了臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)苛養(yǎng)菌及分枝桿菌等難鑒定的病原微生物的識(shí)別效率和能力[6]，目前已快速成為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配備的檢測(cè)技術(shù)[7-8]。

MALDI-TOF MS技術(shù)用于巴爾通體鑒定，無(wú)疑是其鑒定方法的重要補(bǔ)充和發(fā)展。到目前為止，國(guó)際上僅FOURNIER等[9]報(bào)道了應(yīng)用17種、17株巴爾通體參考菌株和39株盲測(cè)菌株進(jìn)行了有關(guān)巴爾通體質(zhì)譜鑒定方法的研究。國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)于巴爾通體質(zhì)譜鑒定方法的研究，且進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)的微生物MALDI-TOF MS儀的數(shù)據(jù)庫(kù)中均無(wú)巴爾通體的參考質(zhì)譜圖，在疾病預(yù)防控制系統(tǒng)和臨床實(shí)驗(yàn)室均無(wú)法應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行巴爾通體鑒定，限制了該技術(shù)在巴爾通體相關(guān)疾病診斷和控制中的應(yīng)用和發(fā)展。在本研究中，課題組應(yīng)用21種、200株巴爾通體菌株，涵蓋了全部重要致病種，建成巴爾通體質(zhì)譜鑒定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，并應(yīng)用173株多宿主多地區(qū)來(lái)源的野生菌株對(duì)樣品處理方法和該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行測(cè)試，證實(shí)MALDI-TOF MS用于巴爾通體菌株鑒定準(zhǔn)確、快速，適用于今后臨床微生物實(shí)驗(yàn)室相關(guān)病原菌的檢測(cè)鑒定。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株 選取21種/亞種巴爾通體，包括漢賽巴爾通體、桿菌樣巴爾通體、五日熱巴爾通體、伊麗莎白巴爾通體、文森巴爾通體伯格霍夫亞種、格拉漢姆巴爾通體、科勒巴爾通體、克氏巴爾通體、道志巴爾通體、文森巴爾通體文森亞種、文森巴爾通體阿魯潘亞種、特利波契巴爾通體、日本巴爾通體、黑瞎子巴爾通體、昆州巴爾通體、森林巴爾通體、庫(kù)珀巴爾通體、非洲跳鼠巴爾通體、麗松鼠巴爾通體、泰勒巴爾通體和地松鼠巴爾通體，200株巴爾通體菌株用于建立MALDI-TOF MS標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)(表1)。應(yīng)用173株巴爾通體野生分離菌株用于驗(yàn)證評(píng)價(jià)所建質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和鑒定方法的可信度(表1)。這些菌株包含12株巴爾通體ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌，其他為北京、山東、河南、青海、西藏和新疆等地的野生菌株，分別分離自貓、犬、獼猴和多種嚙齒動(dòng)物。其他菌株包括牛種布魯氏菌人用疫苗株104M、犬種布魯氏菌RM6/66、根癌土壤桿菌ATCC33970、金黃色葡萄球菌ATCC29213和大腸埃希菌ATCC25922。本研究全部菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

表1 用于建立和評(píng)價(jià)巴爾通體菌MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)的菌株信息

1.2儀器與試劑 Autof ms1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(鄭州安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、371型CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)、NU-425-600E生物安全柜(Nuaire公司)、LabCycler PCR儀(SensoQuest公司)、臺(tái)式離心機(jī)(Sigma公司1-14型)、胰酶大豆瓊脂(BD公司)、三氟乙酸(質(zhì)譜級(jí)，F(xiàn)luka公司)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA，質(zhì)譜級(jí)，Sigma公司)，質(zhì)譜樣本預(yù)處理試劑盒(包括裂解液1、裂解液2、緩沖液和基質(zhì))、微生物質(zhì)譜鑒定儀用校準(zhǔn)品和樣品靶板(鄭州安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，其中裂解液1、裂解液2和緩沖液分別為含甲酸、乙腈和三氟乙酸的溶液；基質(zhì)溶液為α-氨基-4羥基肉桂酸(CHCA)的飽和溶液，在基質(zhì)中加入裂解液2和緩沖液各60 μL充分混勻而成。

1.3方法

1.3.1巴爾通體菌株培養(yǎng)和鑒定 巴爾通體菌株在含有5%脫纖維羊血TSA上復(fù)蘇培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。桿菌樣巴爾通體在28 ℃條件下，用10%脫纖維羊血TSA培養(yǎng)。按菌落生長(zhǎng)速度收獲培養(yǎng)第4～7天新鮮菌體。應(yīng)用引物BhCS.781p-BhCS.1137n擴(kuò)增巴爾通體屬的特異性基因枸櫞酸合酶基因(gltA)進(jìn)行分類(lèi)鑒定[10]。

1.3.2樣品預(yù)處理及靶板制備 在1.5 mL離心管中加入300 μL去離子水，取適量(5～10 mg)巴爾通體菌株新鮮培養(yǎng)物，漩渦震蕩，再加入900 μL無(wú)水乙醇充分混勻，檢測(cè)前置于-40 ℃保存。將上述含樣品的保存液10 000 r/min離心2 min，重復(fù)離心棄上清液，室溫干燥沉淀2～3 min，加50 μL裂解液1漩渦震蕩混勻，再加50 μL裂解液2混勻，10 000 r/min離心2 min，取1 μL上清液，滴加到樣品靶上，晾干至樣品點(diǎn)無(wú)明顯水跡，再取1 μL基質(zhì)溶液(CHCA飽和溶液)覆蓋在樣品點(diǎn)上，晾干至樣品點(diǎn)無(wú)明顯水跡。

將同一菌株的樣品蛋白溶液滴加到8個(gè)不同靶位，同時(shí)選擇1個(gè)靶位滴加儀器校準(zhǔn)品(圖1)，干燥后加基質(zhì)溶液，結(jié)晶形成后放入質(zhì)譜儀，每株菌建庫(kù)前先進(jìn)行校準(zhǔn)，再進(jìn)行樣品質(zhì)譜圖采集。校準(zhǔn)峰值為3 637.772、4 365.343、5 096.776、5 381.446、6 255.444、7 274.467、10 300.032、13 683.173和16 952.332，按照儀器校準(zhǔn)要求進(jìn)行自動(dòng)校準(zhǔn)，達(dá)到4個(gè)峰值符合即為校準(zhǔn)成功。

圖1 巴爾通體MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)靶板制備示意圖

1.3.3MALDI-TOF MS參數(shù)設(shè)置及數(shù)據(jù)采集 在Autof Acquirer軟件中選擇Microbe方法，線性正離子模式，加速電壓20 kV，激光源波長(zhǎng)355 nm，延遲提取時(shí)間250 ns，相對(duì)激光強(qiáng)度為44%，頻率為60 Hz，累加數(shù)40，分子質(zhì)量檢測(cè)范圍2 000～20 000，容差300 ppm；每個(gè)靶位采集3張譜圖，每張譜圖由3次累加組成，峰強(qiáng)度4 000～10 000，最終每個(gè)菌株獲得24張圖譜。在Autof Analyzer軟件中設(shè)置建庫(kù)參數(shù)，譜圖匹配容差200 ppm，最大峰數(shù)目70個(gè)。

1.3.4重復(fù)性驗(yàn)證 選擇8種不同宿主、地域來(lái)源的巴爾通體，每種包含建庫(kù)菌株和測(cè)試菌株各1株進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。每株菌每次采集6個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)質(zhì)譜得分，共計(jì)重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)。

1.3.5野生菌株實(shí)測(cè) 應(yīng)用173株經(jīng)測(cè)序鑒定為巴爾通體的菌株(表1)對(duì)所建立巴爾通體質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證。每株用于驗(yàn)證的菌株均采用直接涂抹法(簡(jiǎn)稱(chēng)“直涂法”)[6]和上述提取法準(zhǔn)備樣品靶板，自動(dòng)采集譜圖。直接涂抹法即用接種針挑取新鮮的單菌落1～2個(gè)，在靶板上涂抹均勻，干燥后覆蓋1 μL的基質(zhì)溶液，晾干至樣品點(diǎn)無(wú)明顯水跡，將樣品靶放入質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。依據(jù)系統(tǒng)自動(dòng)搜庫(kù)結(jié)果進(jìn)行判定，鑒定總分為10分，9.500～10.000分為精確鑒定，9.000～<9.500分為可靠鑒定，6.000～<9.000分為可參考鑒定，<6.000分為無(wú)效(不可靠)鑒定。用建庫(kù)相同的參數(shù)條件對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)將會(huì)用分值的形式給出被測(cè)細(xì)菌與質(zhì)譜庫(kù)中細(xì)菌的匹配情況。

1.3.6巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定的特異性驗(yàn)證 選用牛種布魯氏菌人用疫苗株104M、犬種布魯氏桿菌RM6/66、根癌土壤桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各1株，對(duì)新建巴爾通體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行特異性驗(yàn)證。每株菌每次鑒定時(shí)涂布6個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)，采集6個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)鑒定結(jié)果，觀察質(zhì)譜得分及匹配情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩種樣品處理方法的質(zhì)譜得分比較采用兩樣本W(wǎng)ilcoxon(Mann-Whitney)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1巴爾通體MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)建立 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)方法采集了200株巴爾通體的蛋白指紋圖譜，包含漢賽、五日熱、桿菌樣和伊麗莎白巴爾通體等主要致病性巴爾通體，建立了擁有21種(包括3個(gè)亞種)巴爾通體MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)。

這200株來(lái)自不同地區(qū)的巴爾通體菌株在種水平的主要離子峰一致，每株菌24次采集峰譜數(shù)據(jù)穩(wěn)定，最終形成每個(gè)種的巴爾通體標(biāo)準(zhǔn)蛋白指紋圖譜，圖2以漢賽巴爾通體標(biāo)準(zhǔn)菌株為例展示單次質(zhì)譜圖和24次疊加圖。建庫(kù)后，每株菌按照樣品模式進(jìn)行譜圖采集打靶驗(yàn)證，總得分為(9.631±0.156)分，得分范圍為9.019～9.863分(表2)，全部大于9.000分，屬于“可靠”或“精確鑒定”。

2.2不同樣品處理方法對(duì)巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的影響 應(yīng)用2種不同方法處理60株(13種)巴爾通體菌株，質(zhì)譜鑒定得分均大于9.000分，符合“可靠”或“精確鑒定”。乙醇-甲酸提取法處理細(xì)菌培養(yǎng)物再涂板，全部菌株得分為9.067～9.775分，直接涂靶得分為9.016～9.689分，準(zhǔn)確率均為100%。兩種處理方法的質(zhì)譜得分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。有44株乙醇-甲酸提取法處理后的菌株質(zhì)譜得分高于直接涂靶法得分(圖3)。

注：縱坐標(biāo)為樣品編號(hào)；橫坐標(biāo)為差值(分)。

表3 不同樣品處理方法的巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果(分)

續(xù)表3 不同樣品處理方法的巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 8種、16株巴爾通體菌株在各自的組內(nèi)及組間重復(fù)實(shí)驗(yàn)中質(zhì)譜得分均>9.000分，均值為(9.078±0.031)～(9.776±0.006)分，均鑒定正確；組間CV值在0.06%～1.12%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，質(zhì)譜得分穩(wěn)定(表4)。

表4 MALDI-TOF MS鑒定巴爾通體菌株的重復(fù)性

2.4巴爾通體MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證 將14種、173株巴爾通體菌株培養(yǎng)后用乙醇-甲酸提取法處理，基于新建的巴爾通體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。這173株菌已通過(guò)gltA基因擴(kuò)增、測(cè)序鑒定到種水平。173株測(cè)試菌株全部鑒定到巴爾通體種水平，總得分為9.014～9.796分，平均(9.462±0.195)分，全部菌株得分均>9.000分(圖4)，準(zhǔn)確率為100%。以菌株M59SHD為例，質(zhì)譜鑒定結(jié)果前10位均為數(shù)據(jù)庫(kù)中的漢賽巴爾通體菌株，得分為9.505～9.642分，匹配最高分為ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株(圖5)。

圖4 173株巴爾通體測(cè)試菌株質(zhì)譜得分圖

注：水平軸上下分別為測(cè)試菌株M59SHD和新建數(shù)據(jù)庫(kù)中漢賽巴爾通體的ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.5巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定的特異性驗(yàn)證 牛種布魯氏菌人用疫苗株104M的質(zhì)譜得分為6.136～7.809分，平均(6.705±0.662)分，匹配第1位菌株為犬種布魯氏菌；犬種布魯氏菌RM6/66的質(zhì)譜得分為6.162～7.633分，平均(7.104±0.592)分，匹配第1位菌株為犬種布魯氏菌；根癌土壤桿菌質(zhì)譜得分結(jié)果為6.123～8.215分，平均(6.751±0.764)分，匹配第1位菌株為放射根瘤菌；金黃色葡萄球菌質(zhì)譜得分為9.018～9.372分，平均(9.103±0.135)分，大腸埃希菌的質(zhì)譜得分為9.214～9.598分，平均(9.453±0.135)分。在這5種細(xì)菌每個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)的匹配結(jié)果中，前10位均未出現(xiàn)巴爾通體屬細(xì)菌。

3 討 論

MALDI-TOF MS無(wú)疑是近年在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于診斷感染性疾病最成功的生物化學(xué)技術(shù)之一。MALDI-TOF MS主要用來(lái)鑒定已培養(yǎng)出的細(xì)菌和真菌，某些生物樣品如尿液等不經(jīng)培養(yǎng)簡(jiǎn)單預(yù)處理后也可直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。從1975年ANHALT等[11]首次提出用質(zhì)譜技術(shù)鑒定細(xì)菌，到1999年HOLLAND等[12]首次報(bào)道應(yīng)用無(wú)須預(yù)處理的全菌蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜技術(shù)簡(jiǎn)單化、快速化和結(jié)果讀取“傻瓜化”的轉(zhuǎn)變，奠定了該技術(shù)快速普及的基礎(chǔ)。此后，大量相關(guān)研究陸續(xù)開(kāi)展，并于21世紀(jì)開(kāi)始將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室。FREIWALD等[13]的“細(xì)菌質(zhì)譜系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)和鑒定”的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)提供了詳盡的操作流程和說(shuō)明，CLARK等[14]詳細(xì)綜述了MALDI-TOF MS用于各種革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌、厭氧菌、苛養(yǎng)菌和各種真菌鑒定的研究，他們都指出這一技術(shù)將替代部分傳統(tǒng)方法，皆歸因于其特異、快速、穩(wěn)定和低成本的優(yōu)點(diǎn)。

操作簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確使得MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床應(yīng)用上很受歡迎，只需把菌培養(yǎng)出來(lái)，菌量無(wú)須過(guò)多、單個(gè)菌落即可，直接涂抹在靶面上，裝載到儀器中，簡(jiǎn)單按幾次鼠標(biāo)，1 min內(nèi)結(jié)果就展示出來(lái)。對(duì)于巴爾通體這種苛養(yǎng)菌，沒(méi)有表型特征、沒(méi)有生化代謝特異反應(yīng)，目前只能通過(guò)PCR測(cè)序進(jìn)行鑒定，建立質(zhì)譜鑒定方法將極大推動(dòng)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)這類(lèi)細(xì)菌的識(shí)別能力。

MALDI-TOF MS識(shí)別細(xì)菌體內(nèi)穩(wěn)定且豐富的核糖體蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量在2 000～20 000[15-16]，因此，相較于其他化學(xué)分類(lèi)法如細(xì)胞壁脂肪酸法，不易受培養(yǎng)條件的影響，全菌蛋白質(zhì)譜峰信號(hào)穩(wěn)定，有利于鑒定和比較。依據(jù)常規(guī)方法，本課題組選取了統(tǒng)一培養(yǎng)條件下平板上穩(wěn)定生長(zhǎng)期的菌落，通常為培養(yǎng)4～6 d，但有些種類(lèi)如桿菌樣巴爾通體生長(zhǎng)更為緩慢，這也使得一切基于菌落培養(yǎng)的鑒定方法檢測(cè)速度降低，成為MALDI-TOF MS鑒定巴爾通體的限速步驟，也是該方法的局限性所在。不過(guò)一旦平板上開(kāi)始出現(xiàn)菌落就可以快速完成鑒定。

對(duì)于一般生長(zhǎng)在固體瓊脂平板上的細(xì)菌，直接涂靶是常規(guī)做法，有效地節(jié)省了中間步驟、試劑和操作過(guò)程中增加污染的可能性，是最簡(jiǎn)單、快速有效的方法，在臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用。但是，在某些細(xì)菌或特殊菌株的鑒定時(shí)，乙醇-甲酸或者乙酸-乙腈等提取法可以增加細(xì)菌蛋白的裂解質(zhì)量，提高鑒定準(zhǔn)確率[5]。巴爾通體菌落小但是形態(tài)多樣，有些干燥，有些向瓊脂平板下陷生長(zhǎng)，還有些黏滑不易挑取，一次直涂操作不易成功，這種情況下采用提取法是較好的解決辦法。

準(zhǔn)確的診斷要求鑒定方法的穩(wěn)定性，除了穩(wěn)定的設(shè)備、優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件和良好的操作技術(shù)，MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)參考菌株庫(kù)的需求是這一技術(shù)的特點(diǎn)之一[17]。在MALDI-TOF MS微生物數(shù)據(jù)庫(kù)中不同來(lái)源的流行菌株越多，在臨床診斷中對(duì)未知菌株的命中率越高，否則可能因匹配得分低導(dǎo)致鑒定失敗。本課題組建立的巴爾通體MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)菌種和菌株數(shù)量多、來(lái)源廣泛，不同來(lái)源地和不同宿主來(lái)源沒(méi)有影響巴爾通體在種屬水平上的準(zhǔn)確鑒定。應(yīng)用8種、16株巴爾通體進(jìn)行的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)獲得良好測(cè)試效果，符合率達(dá)到100%，表明MALDI-TOF MS技術(shù)可以穩(wěn)定、準(zhǔn)確地在種水平鑒定巴爾通體。野生菌株的鑒定結(jié)果是評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)質(zhì)量最有說(shuō)服力的數(shù)據(jù)，與FOURNIER等[9]的研究相比，本研究的建庫(kù)菌株不僅更多(21種/亞種vs. 17種，200株vs. 17株)，而且用于測(cè)試的野生菌株數(shù)量增加了4倍(173株vs. 39株)，可以更有效地驗(yàn)證和評(píng)估所建巴爾通體質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和技術(shù)方法的可靠性。經(jīng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)試，質(zhì)譜得分均>9.000分，CV值顯示組內(nèi)和組間測(cè)量值變異非常小，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)和組間上樣進(jìn)行譜圖采集均不會(huì)影響鑒定結(jié)果，方法穩(wěn)定。Autof ms1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)中已有細(xì)菌4 000余種，沒(méi)有巴爾通體屬細(xì)菌。在建庫(kù)前，為觀察是否存在非特異性鑒定結(jié)果的情況，本課題組進(jìn)行了巴爾通體菌株打靶搜庫(kù)，未發(fā)現(xiàn)非特異鑒定的高分結(jié)果，表明原始庫(kù)中4 000余種細(xì)菌對(duì)巴爾通體鑒定無(wú)干擾，不存在非特異性鑒定可能。進(jìn)一步對(duì)近源菌包括布魯氏菌和根癌土壤桿菌的鑒定結(jié)果表明，用MALDI-TOF MS方法鑒定巴爾通體不會(huì)發(fā)生非特異性的識(shí)別錯(cuò)誤，基于新建巴爾通體數(shù)據(jù)庫(kù)可以特異性地辨別巴爾通體屬細(xì)菌。限于巴爾通體菌種、菌株資源有限，本研究未能將目前已知的全部巴爾通體種類(lèi)涵蓋進(jìn)去，而且有些種類(lèi)菌株數(shù)量較少，該數(shù)據(jù)庫(kù)并不完善，在未來(lái)使用過(guò)程中可能導(dǎo)致某些巴爾通體種類(lèi)鑒定不到種水平，或者種水平鑒定錯(cuò)誤。這種情況實(shí)際上是質(zhì)譜技術(shù)用于細(xì)菌鑒定時(shí)的共同問(wèn)題，這一局限性有待通過(guò)不斷向數(shù)據(jù)庫(kù)中補(bǔ)充菌種和菌株數(shù)據(jù)來(lái)解決。

本課題組完成了21種/亞種巴爾通體標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，構(gòu)建了巴爾通體標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，可用于巴爾通體菌株的種屬水平鑒定。最后，為便于有關(guān)專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室研究人員和臨床檢驗(yàn)醫(yī)師參考和交流，筆者提出“巴爾通體質(zhì)譜鑒定標(biāo)準(zhǔn)化操作流程”的建議，包括菌株分離培養(yǎng)、樣品處理和自動(dòng)化質(zhì)譜分析(圖6)。簡(jiǎn)述如下，第1步：在37 ℃、5%CO2、濕度>70%培養(yǎng)條件下，復(fù)蘇培養(yǎng)巴爾通體菌株，4～6 d；第2步：直涂法或者乙醇-甲酸提取法制備質(zhì)譜樣品，1～10 min；第3步：靶板上樣并裝載到質(zhì)譜儀，3 min；第4步：設(shè)置參數(shù)、編輯樣品表單、采集圖譜鑒定并輸出結(jié)果，<1 min。

圖6 巴爾通體質(zhì)譜鑒定標(biāo)準(zhǔn)化操作流程示意圖