miR-448在潰瘍性結腸炎組織中的表達水平及意義

羅 鵬 丁 云 劉有理

潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性腸道炎性疾病，其發病率呈逐年上升趨勢[1]。UC具有病程長、復發率高、并發癥多的特點，臨床特征常表現為便血、腹痛及高熱等[2-3]。隨著UC病情進展，患者可出現腸道狹窄、梗阻、穿孔等結構性損傷，嚴重時可誘發UC相關結直腸癌[4-5]。因此，早期評估UC疾病活動度及預后情況，及時采取有效措施控制病情，對于改善患者預后具有重要意義。目前，臨床常通過腸道炎性反應狀態評估腸黏膜愈合情況，但存在一定不足。改良Mayo評分及Truelove-Witts分級等臨床評分可反映UC患者的主觀癥狀，但有部分緩解期UC患者可能存在持續的黏膜炎性反應[6]。部分常用的生物學標志物受外界因素干擾較大，判斷腸道炎性反應狀態的特異度較差[7]。結腸鏡檢查是目前界定UC患者腸道黏膜狀況的金標準，但其為侵入性檢查，且在評估患者黏膜病變時存在滯后性[8]，難以在臨床上廣泛應用。因此，亟需探尋客觀、準確的生物學指標用于判定UC疾病活動度及患者預后情況。核因子-κB(NF-κB)可調節多種參與腸道免疫反應及炎性反應的細胞因子的表達水平，進而參與UC的發生、發展過程[9]，而miR-448可通過絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶途徑，誘導NF-κB的活化[10]，由此推測miR-448可能與UC的發生、發展存在聯系。本研究對miR-448與UC疾病活動度及患者預后的關系進行分析，以期為臨床評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2015年7月至2017年7月宣城市人民醫院收治的67例UC患者作為研究對象，設為UC組。UC患者均參照《中國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見》[11]中的標準確診。67例UC患者經結腸鏡檢查發現，24例處于緩解期，43例處于活動期。納入標準：(1)首次確診為UC；(2)入組前未服用免疫抑制劑、非甾體類抗炎藥等藥物；(3)簽署知情同意書。排除標準：(1)伴有惡性腫瘤；(2)伴有全身感染性疾病；(3)伴有中毒性結腸擴張等；(4)妊娠期或哺乳期婦女；(5)隨訪失聯。選取同期在本院行結腸息肉切除術的60例受試者作為對照組。UC組男性40例，女性27例，年齡19～43歲，平均年齡為(28.57±3.19)歲，平均體質量指數(BMI)為(20.69±3.28)kg/m2。對照組男性35例，女性25例，年齡為22～43歲，平均年齡為(29.05±3.37)歲，平均BMI為(21.42±3.15)kg/m2。兩組在性別(χ2=0.025，P=0.876)、年齡(t=0.824，P=0.411)、BMI(t=1.276，P=0.204)方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

收集患者的年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、病變范圍、腸道損傷、腸切除術史、不典型增生、肛周病變(肛裂、肛周膿腫、肛瘺)、家族史、基底漿細胞增多等資料。67例患者中有13例肛周病變，其中肛裂3例，肝周膿腫6例，肛瘺4例。

抽取受試者入組次日清晨空腹肘靜脈血5 mL，室溫下4 000 r/min離心10 min，分離上層血清，置于-20 ℃冰箱待測。采用免疫比濁法檢測血清C反應蛋白(CRP)表達水平，試劑盒購自南京基蛋生物科技有限公司。采用MC-600Vet全自動血細胞分析儀(購自深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)測定血液紅細胞沉降率(ESR)、血紅蛋白表達水平。采用化學發光免疫分析法檢測血清白細胞介素-15(IL-15)表達水平，試劑盒購自北京普朗醫療有限公司。

采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測UC患者的miR-448相對表達量，試劑盒購自德國羅氏公司。在無菌條件下取得患者的黏膜組織，30 min內將保存組織的凍存管置于液氮罐中保存。檢測時在無菌條件下將UC黏膜組織及結腸息肉組織置于液氮中研磨，之后4 000 r/min離心15 min，分離上層清液置于EP管中，待驗。應用TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度。應用核酸蛋白儀和瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA進行分析。取2 μL總RNA置于反轉錄試劑盒中進行反轉錄反應，合成cDNA。最后用PCR擴增儀進行擴增，反應條件為：94 ℃ 5 min預變性，之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt表示miR-448的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 UC疾病活動度

采用改良Mayo評分評估UC疾病活動度，主要從排便、便血、內鏡及醫師總體評價4個方面進行評估[11]，評分標準見表2。Mayo評分≤2分且無單個分項評分>1分為緩解期，>2分為活動期，其中3～5分為輕度，6～10分為中度，11～12分為重度。

表2 UC疾病活動度劃分

1.4 隨訪

采用復診方式對患者進行隨訪，隨訪起始時間為2015年7月18日，截止時間為2019年8月6日。記錄患者預后情況，本研究將復發、行結腸手術、UC相關黏膜異型增生及UC相關結直腸癌定義為預后不良[12]。復發指經藥物治療進入緩解期后，UC相關癥狀再次出現，并有實驗室炎性指標、內鏡檢查及影像學檢查的疾病活動證據。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 兩組miR-448相對表達量比較

UC組miR-448的相對表達量為1.42±0.36，高于對照組(0.81±0.19)，兩組比較差異有統計學意義(t=11.739，P<0.001)。

2.2 不同病變部位miR-448相對表達量比較

67例患者中病變位于直腸有18例，左半結腸30例，廣泛結腸19例。直腸組、左半結腸組和廣泛結腸組中miR-448的相對表達量分別為1.38±0.33、1.43±0.35、1.44±0.38，3組比較差異無統計學意義(F=0.163，P=0.855)。

2.3 不同疾病活動度UC患者miR-448相對表達量比較

67例患者中，緩解期24例，活動期43例，其中輕度12例、中度16例、重度15例。緩解期、輕度組、中度組、重度組UC患者miR-448的相對表達量分別為1.11±0.18、1.29±0.21、1.55±0.28、1.88±0.30，4組比較差異有統計學意義(F=34.098，P<0.001)。緩解期miR-448相對表達量低于輕度組、中度組及重度組(q=2.985，P<0.05；q=7.992，P<0.05；q=13.715，P<0.05)，輕度組低于中度組及重度組(q=3.991，P<0.05；q=8.931，P<0.05)，中度組低于重度組(q=5.383，P<0.05)。

2.4 miR-448與UC患者預后的關系

67例UC患者隨訪期間預后不良發生率為41.79%(28/67)，其中復發23例(34.33%)，腸腔狹窄行結腸切除術1例(1.49%)，腸梗阻反復發作行腸切除術2例(2.99%)，UC相關黏膜異型增生2例(2.99%)。預后不良組miR-448的相對表達量為1.52±0.39，高于預后良好組(1.34±0.31)，差異有統計學意義(t=2.103，P=0.039)。miR-448評估UC患者預后的AUC、敏感度、特異度、最大約登指數、最佳截斷點分別為0.854(95%CI：0.747～0.929)、75.00%、92.31%、0.673、1.55。見圖1。

圖1 miR-448評估UC患者預后的ROC曲線

2.5 預后不良組與預后良好組的基本資料比較

預后不良組與預后良好組在年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、病變范圍、腸道損傷、腸切除術史、不典型增生、CRP、ESR、IL-15、血紅蛋白、治療方案方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)；而在肛周病變、家族史、基底漿細胞增多方面比較，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 預后不良組與預后良好組的基本資料比較

2.6 影響UC患者預后的相關因素

根據miR-448評估UC患者預后的最佳截斷點(1.55)將其轉換為二分類變量。將肛周病變(無=0，有=1)、家族史(無=0，有=1)、基底漿細胞增多(無=0，有=1)、miR-448(<1.55=0，≥1.55=1)作為自變量，α入=0.05，α出=0.10，將UC患者的預后情況(預后良好=0，預后不良=1)作為因變量納入多因素Logistic回歸模型，結果顯示肛周病變、miR-448與UC患者預后密切相關。見表4。

表4 影響UC患者預后的因素

3 討論

微RNA(miRNA)是由約22個核苷酸組成的內源性非編碼RNA，在進化上趨于保守，通過以序列特異性方式結合靶基因的特定區域，從而調節轉錄后基因的表達[13-14]。近年來研究表明miRNA與多種疾病的病理生理過程密切相關，已成為臨床研究的熱點[15-16]。miR-448為miRNA家族一員，有研究表明其可參與結直腸癌、心肌病等的發生、發展過程[17-18]。有報道指出，miR-448可誘導NF-κB的活化[10]，而NF-κB過表達可誘發腸道免疫性疾病[9]。目前關于miR-448在UC中的表達水平及其與UC疾病活動度、患者預后關系的報道較少。

本研究結果顯示，UC患者miR-448相對表達量高于對照組，提示miR-448可能與UC的發生有關。本研究比較了緩解期與活動期患者miR-448的相對表達量，結果顯示活動期患者miR-448相對表達量高于緩解期，重度組miR-448相對表達量高于中度組及輕度組，中度組miR-448相對表達量高于輕度組，以上結果提示miR-448與UC疾病活動度可能相關。此外，本研究對UC患者的隨訪發現，預后不良組患者miR-448相對表達量高于預后良好組，提示檢測miR-448相對表達量有助于評估UC患者預后。本研究構建了miR-448評估UC患者預后的ROC曲線，結果顯示miR-448評估UC患者預后的AUC大于0.8，提示miR-448評估UC患者預后的效能較高。本研究采用多因素Logistic回歸分析影響UC患者預后的相關因素，結果顯示肛周病變、miR-448與UC患者預后密切相關，結果與既往研究相符[19-20]。

NF-κB的活性狀態與腸道炎性反應密切相關。機體處于穩態時，NF-κB與其抑制因子IκB單體耦聯，以無活性復合體形式存在于細胞質中，受到細胞外信號刺激后IκB磷酸化后降解，NF-κB釋放并移入核內與靶基因序列上特定的結合位點結合[21]，啟動或調節腫瘤壞死因子-α及黏附因子-1的基因轉錄，介導炎性細胞因子的活化、趨化、浸潤，參與UC的發生、發展過程[22]。有細胞實驗表明，miR-448表達變化可引起雙向調節因子及表皮生長因子水平升高，進而介導NF-κB的激活[10]。由此推測，miR-448可能通過誘導NF-κB的活化，參與UC的疾病進展。

綜上所述，miR-448與UC疾病活動度及患者預后關系密切，檢測miR-448表達水平有助于評估患者預后情況。本研究今后將進一步分析miR-448參與UC疾病活動度及預后的病理生理機制。