結直腸癌患者組織中miR-99a和miR-100表達水平與腫瘤轉移的關系

郟 鵬 潘 冰 汪 洋 趙武華

結直腸癌是中國常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內其發病率和病死率分別居惡性腫瘤的第3位和第4位，復發或轉移是其高病死率的主要原因[1-2]。微RNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要參與轉錄后基因表達調控[3]。miRNA通過與信使RNA(mRNA)靶標的3′-UTR互補結合，在轉錄后水平抑制蛋白質合成，可參與多種消化系統疾病的發生、進展[4-5]。有研究發現多種miRNA在結直腸癌組織及正常組織中存在差異性表達，并與患者生存率密切相關[6-7]。目前關于miR-100表達對結直腸癌患者預后的影響存在不一致的結論，張善信等[8]研究發現，miR-100雖然具有抑癌作用，但其表達水平對結直腸癌患者的總體生存率并無顯著影響；Chen等[9]則認為，miR-100低表達患者的總體生存期較短。方志雄等[10]將miR-99a導入肝癌HepG2細胞，通過細胞生長曲線與平皿克隆實驗觀察發現，miR-99a高表達后肝癌細胞的生長速度明顯減慢，增殖能力降低，提示miR-99a在肝細胞癌中可能發揮著抑癌作用。目前關于miR-99a在原發性結直腸癌患者中的表達水平及臨床意義的報道較少。本文探究了miR-99a、miR-100在結直腸癌的發生、發展中的作用，以期為進一步研究其在結直腸癌中的生物學功能，以及篩選相關下游靶基因奠定基礎。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2014年1月至2019年1月臺州市第一人民醫院收治的84例結直腸癌患者作為研究對象，所有患者行結直腸癌根治術治療，手術結束后，在不影響病理診斷取材需要的前提下采集組織樣本。收集患者的腫瘤組織、癌旁組織及正常組織，癌旁組織距離腫瘤組織約1 cm，正常組織取自距腫瘤組織5 cm以上的手術標本。采集組織樣本后，將組織樣本迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80 ℃冰箱，這一過程均在手術標本離體后30 min內完成。納入標準：(1)患者均符合《中國結直腸癌診療規范(2017年版)》中有關結直腸癌的診斷標準[11]；(2)均行根治性手術治療；(3)首次診斷并治療；(4)術前未行放射、化學治療等抗腫瘤治療；(5)病歷資料完整。排除標準：(1)結直腸癌復發者；(2)合并其他急慢性感染性疾病；(3)合并全身其他系統的惡性腫瘤；(4)依從性差，隨訪資料不全。84例患者中，男性51例，女性33例，年齡為45～78歲，平均年齡為(61.5±5.8)歲。收集患者的病歷資料及手術相關記錄，納入患者性別、年齡、分化程度、組織學類型、浸潤深度、是否存在淋巴結轉移、Duke′s分期等指標。

1.2 組織中miR-99a、miR-100表達水平的檢測

患者組織標本保存于本院實驗室或病理科，每份樣品均包括結直腸癌組織、癌旁組織和正常組織。將液氮中的標本進行研磨，使用TRIzol試劑盒(購自美國智雅生物技術有限公司)提取標本中的總RNA，使用RNA反轉錄試劑盒(購自日本Takara公司)合成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-99a、miR-100的相對表達量，試劑盒購自美國Abcam公司。引物由武漢博士德生物工程有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應體積為20 μL，95 ℃加熱3 min滅活殘余蛋白酶，之后設置反應參數95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，總計40個循環，設置4個重復孔。以U6作為內參，計算Ct值，采用2-△△Ct表示各組織中miR-99a、miR-100的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 隨訪

采用門診或電話的形式進行隨訪。術后每3個月門診隨訪1次，之后每6個月隨訪1次，直至隨訪終點或失訪。總生存期(OS)定義為從隨機化開始至因任何原因死亡的時間。隨訪截止時間為2019年12月31日。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 miR-99a、miR-100在結直腸組織中的表達水平

結果顯示，miR-99a在結直腸癌組織、癌旁組織、正常組織中的相對表達量分別為3.15±1.52、5.98±1.73、8.63±1.98，miR-100的相對表達量分別為2.86±1.05、5.64±1.47、8.52±1.56。miR-99a、miR-100在結直腸癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁組織及正常組織，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 miR-99a、miR-100在結直腸患者組織中的表達水平 A miR-99a B miR-100

2.2 miR-99a、miR-100的表達水平與患者臨床病理學特征的關系

單因素分析顯示，與腫瘤浸潤深度≥T2期，有淋巴結轉移者，Duke′s分期為C、D期者相比較，腫瘤浸潤深度為T1期、無淋巴結轉移者、Duke′s分期為A、B期患者的miR-99a、miR-100相對表達量均較高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-99a、miR-100表達水平與患者臨床病理學特征的關系

2.3 影響患者復發或腫瘤轉移的Cox多因素分析

隨訪發現，84例患者中23例出現了腫瘤復發或轉移，發生率為27.4%。

以miR-99a的中位相對表達量(3.19)為標準，將患者分為miR-99a低表達組和高表達組；以miR-100的中位相對表達量(2.85)為標準，將患者分為miR-100低表達組和高表達組。Cox生存回歸分析結果發現，Duke′s分期、miR-99a、miR-100是影響患者復發或腫瘤轉移的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響患者復發或腫瘤轉移的Cox多因素分析

2.4 miR-99a、miR-100的表達水平對患者OS的影響

生存分析Log-rank檢驗結果顯示，miR-99a低表達組的OS顯著低于miR-99a高表達組(χ2=7.56，P<0.001)，miR-100低表達組的OS顯著低于miR-100高表達組(χ2=13.35，P<0.001)，即miR-99a、miR-100表達水平越低，患者預后越差。見圖2。

圖2 miR-99a、miR-100的表達水平對患者OS的影響 A miR-99a B miR-100

3 討論

結直腸癌是世界上發病率和病死率較高的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬人被診斷為結直腸癌[12]，腫瘤的復發和轉移是導致患者死亡的主要原因。轉移是指細胞從原發腫瘤向非鄰近器官擴散并形成繼發腫瘤的多步驟過程。這一過程包括原發腫瘤的生長、血管生成、腫瘤細胞侵襲、淋巴管/血管內滲、遠處器官滲出以及轉移瘤的定植和生長[13]。由于及時治療處于非轉移期的結直腸癌患者可以提高生存率，因此，深入了解結直腸癌轉移的分子途徑，開發新的預后分子標志物，有助于減少結直腸癌轉移的發生。miRNA在細胞的遷移、增殖、分化和凋亡等多個生理過程中發揮重要作用，其異常表達與腫瘤的生物學行為密切相關[14-15]。miRNA可能在結直腸癌轉移的各個階段發揮作用，包括血管生成、侵襲、內滲、循環、外滲和轉移定植等，已有報道指出多種miRNA可作為預測結直腸癌預后的標志物[16]。

在絕大多數惡性腫瘤中存在miRNA的異常表達，其在腫瘤的發生、發展中可能發揮促癌作用或抑癌作用。本研究結果顯示，miR-99a、miR-100在結直腸癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁組織和正常組織，提示miR-99a和miR-100在結直腸癌組織中可能發揮抑癌作用。此外，研究結果顯示，在正常組織、癌旁組織、結直腸癌組織中，miR-99a及miR-100的表達水平依次降低，提示結直腸癌細胞具有更高的侵襲表型，這可能與miR-99a、miR-100啟動子區域的高甲基化導致兩者表達降低有關[17-18]。本研究對患者的臨床病理參數進行分析發現，miR-99a、miR-100的相對表達量越低，則患者的浸潤深度越大、Duke′s分期越高，越易出現淋巴結轉移，提示隨著miR-99a、miR-100表達水平的降低，腫瘤生物學行為的惡性程度越高。

在結直腸癌中，腫瘤細胞從腫塊中解離，穿過基底膜，到達血管/淋巴管的確切機制尚不清楚。有報道指出，miR-99a在子宮內膜癌細胞中可通過降低PI3K/AKT/mTOR信號通路活性抑制細胞增殖，阻滯G1/S期轉變，誘導細胞凋亡，并抑制小鼠體內腫瘤生長[19]。Fujino等[20]研究發現，miR-100在結直腸癌組織中的表達水平顯著降低，可用于預測早期結直腸癌是否出現淋巴結轉移。以上研究均提示，miR-99a與miR-100在惡性腫瘤中可能更多地發揮著抑癌作用，當兩者表達下調時，可導致腫瘤形成的抑制性機制部分失靈，提高了腫瘤的侵襲和轉移能力。本研究隨訪發現，miR-99a低表達組、miR-100低表達組患者的總體生存率均顯著高于相應的高表達組，即miR-99a、miR-100的表達水平越高，患者預后情況越好。推測這是由于高表達miR-99a、miR-100患者的臨床病理參數更為理想，腫瘤侵襲性相對較低，致使患者的總體生存率相對更理想。

綜上所述，miR-99a和miR-100在結直腸癌患者組織中的表達水平明顯降低，提示其具有潛在的抑癌作用。但本研究的樣本量較小，今后應在增加樣本量的基礎上，實施更大規模的研究，或能得出更具說服力的結論。