炎癥性腸病患者血清miR-181a-5p和miR-126表達水平及其與腸道菌群相關性的研究

崔 昭 梁 博 李國東 李會榮

炎癥性腸病(IBD)為腸道慢性炎性疾病，包括潰瘍性腸炎(UC)與克羅恩病(CD)，其臨床癥狀主要為腹瀉、腹痛、血便等，目前IBD的發病機制尚未完全明確[1-2]。研究顯示腸道黏膜免疫異常可引發炎性反應，而腸道菌群異常可導致免疫紊亂[3]，因此深入分析腸道菌群組成變化與IBD發病的相關性具有重要意義。既往研究顯示微RNA(miRNA)在IBD發生過程中發揮著重要作用[4-5]。miR-181a-5p在急性胰腺炎模型細胞中呈高表達，可導致細胞炎性損傷[6]。研究表明miR-126在支氣管哮喘患者的血漿中表達異常，并參與了炎性疾病的發生、發展[7]。目前miR-181a-5p、miR-126在IBD血清中的表達情況尚不明確。因此，本研究主要探討miR-181a-5p、miR-126在IBD患者血清中的表達水平及其與腸道菌群的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年10月至2018年12月保定市第二醫院收治的100例活動期IBD患者作為研究組，所有患者均符合相關診斷標準[8]，其中男性56例，女性44例，年齡25～60歲，平均年齡為(43.26±5.48)歲；研究組中包括60例UC患者(UC組)和40例CD患者(CD組)；60例UC患者中，男性31例，女性29例，年齡25～58歲，平均年齡為(44.16±6.12)歲；40例CD患者中，男性25例，女性15例，年齡28～60歲，平均年齡為(42.16±7.11)歲。另選擇同期于本院體檢的50名健康志愿者作為對照組，其中男性30名，女性20名，年齡23～60歲，平均年齡為(45.26±7.48)歲。各組年齡、性別的差異均無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有入組者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 抽取所有入組者清晨空腹靜脈血5 mL，4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，吸取血清置于離心管內，保存于-20 ℃冰箱內。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測miR-181a-5p、miR-126表達水平 采用TRIzol法提取血清中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。反轉錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μL；反應條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time qPCR)擴增，反應體系：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL；反應條件：95 ℃ 2 min預變性，之后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-181a-5p、miR-126的相對表達量。TRIzol試劑、反轉錄與PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。

表1 引物序列

1.2.3 細菌培養與鑒定 采集所有入組者糞便10 g，置于厭氧罐內，采用日本光岡知足法培養細菌，本研究選用以下腸道菌群進行培養：腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬、小梭菌屬、真桿菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬。細菌經革蘭染色、生物化學實驗進行陽性判斷，并計算樣本中各菌屬水平。菌落數據取其對數值lgN(CFU/g)。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組血清miR-181a-5p、miR-126表達比較

與對照組相比，研究組、UC組、CD組的血清miR-181a-5p、miR-126的相對表達量均顯著升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組血清miR-181a-5p、miR-126相對表達量比較()

2.2 各組菌群數量比較

與對照組相比，UC組腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬、小梭菌屬數量顯著增多(P<0.05)，CD組腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬數量顯著增多(P<0.05)。見表3。

表3 各組菌群數量比較(lgN)

2.3 各組菌群培養陽性率比較

細菌培養與鑒定結果顯示，與對照組相比，UC組擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬的培養陽性率顯著升高(P<0.05)；與對照組相比，CD組酵母菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬的培養陽性率顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組菌群陽性率比較

2.4 血清miR-181a-5p、miR-126不同表達組的菌群數量比較

根據miR-181a-5p、miR-126表達水平的平均數(2.58、2.64)將患者分為miR-181a-5p高表達組和miR-181a-5p低表達組、miR-126高表達組和miR-126低表達組。與miR-181a-5p低表達組相比，miR-181a-5p高表達組腸球菌屬、酵母菌屬、葡萄球菌屬的數量顯著增多(P<0.05)；與miR-126低表達組相比，miR-126高表達組腸球菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、葡萄球菌屬的數量顯著增多(P<0.05)。見表5。

表5 IBD患者血清miR-181a-5p、miR-126不同表達組間菌群數量比較[lgN，]

2.5 血清miR-181a-5p、miR-126表達與菌群數量的相關性分析

采用Pearson法分析IBD患者血清miR-181a-5p、miR-126表達水平與菌群數量的相關性，結果顯示血清miR-181a-5p表達水平與腸球菌屬、酵母菌屬、雙歧桿菌屬、腸桿菌屬呈負相關(P<0.05)，血清miR-126表達水平與消化球菌屬、葡萄球菌屬呈負相關(P<0.05)。見表6。

表6 血清miR-181a-5p、miR-126表達與菌群數量的相關性

3 討論

miRNA在IBD患者血清中異常表達，其表達水平與機體炎性反應密切相關[9-10]。但miRNA表達水平與IBD患者腸道菌群的相關性研究相對較少。因此，本研究探討了miR-181a-5p、miR-126在IBD患者血清中的表達水平，并分析其與IBD患者腸道菌群的相關性，為揭示IBD發病機制提供參考。

miR-181a-5p在血管炎性疾病、膿毒癥等多種疾病中表達上調，并可促進炎性反應的發生[11-12]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示miR-181a-5p在IBD患者血清中呈高表達，提示miR-181a-5p表達水平升高可能促進IBD的發生。研究表明miR-126在消化系統疾病患者中表達異常并可促進IBD的發生[13]。另有研究指出miR-126在支氣管肺炎患者血清中表達水平升高，并可能促進炎性反應[14]。本研究結果顯示IBD患者血清miR-126表達水平升高，提示miR-126表達水平升高可能參與IBD發生過程。腸道菌群可形成相對穩定的狀態并可保護腸道健康，若腸道環境發生改變可引起腸道菌群組成異常，進而促使腸道微生態破壞而導致腸道感染的發生[15]。本研究結果顯示UC組腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬、小梭菌屬數量顯著多于對照組，CD組腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬數量顯著多于對照組；UC組擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬的培養陽性率顯著高于對照組，CD組酵母菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬的培養陽性率顯著高于對照組，與相關報道結果相符[16]。這提示IBD患者存在腸道菌群失調，分析原因可能是腸道菌群中致病菌數量增加可破壞腸道微生態造成腸黏膜功能障礙，研究表明腸黏膜功能障礙的發生可降低機體免疫力，從而促進腸道炎性反應的發生[17]。本研究結果顯示miR-181a-5p和miR-126高表達組的腸球菌屬、葡萄球菌屬數量顯著高于低表達組，進一步分析miR-181a-5p、miR-126表達水平與菌群數量的相關性，結果顯示miR-181a-5p表達水平與腸球菌屬、酵母菌屬、雙歧桿菌屬、腸桿菌屬呈負相關，miR-126表達水平與消化球菌屬、葡萄球菌屬呈負相關，提示IBD患者血清miR-181a-5p、miR-126水平與腸道菌群組成的變化密切相關。分析原因可能為菌群數量改變導致腸道黏膜功能障礙，造成腸道免疫應答功能紊亂，而腸道菌群可參與機體糖脂代謝過程，血清miR-181a-5p、miR-126水平升高可促進炎性反應的發生，促進IBD發生，進而導致腸道功能障礙。

綜上所述，IBD患者血清中miR-181a-5p與miR-126的表達水平升高，兩者表達水平與腸道菌群組成變化密切相關，其具體作用機制仍需進一步探究。