多模態眼前段成像設備的研發及應用

段錚昱，肖鵬，駱仲舟，王耿媛，袁進

(中山大學中山眼科中心工程中心，廣州 510000)

眼表疾病通俗的是指眼睛表面的疾病，泛指損害累及角膜和結膜眼表正常結構與功能的疾病，例如結膜炎、角膜炎、干眼癥都統稱為眼表疾病。在眼部結構中，眼表組織與外界直接接觸，易發生感染、炎癥、創傷等疾病，嚴重情況會影響人們的健康和生活質量，眼表致盲性疾病是僅次于白內障、青光眼和老年性黃斑變性的世界第4大致盲原因，尤其在發展中國家盛行[1-3]。大多數的眼表疾病存在著多種臨床癥狀。例如角膜炎主要由角膜炎癥引起，典型表現為角膜上皮缺損甚至基質浸潤，嚴重的可引起周圍結膜血管擴張、變形、充血，甚至導致血管生長異常[4-6]。目前，臨床診斷通常采用裂隙燈顯微鏡、光學相干斷層掃描儀(optical coherence tomography，OCT)等多種檢查設備，結合熒光染色等成像方式來提供多模式和多維的圖像，獲取綜合信息，進行眼表疾病的診斷和治療評估[7-8]。

裂隙燈顯微鏡是應用最廣的眼科常規眼表檢查設備[9]。通過向眼睛照射1束狹縫光，利用丁達爾效應的原理，可對角膜、結膜等前段組織的病理變化進行立體評價。然而，傳統的裂隙燈顯微鏡由于其有限的放大倍數和較差的空間分辨率，使其難以對病理結構進行更高精度的評價及準確的生物學參數測量[10-12]。20世紀90年代發展起來的O CT，以其非接觸、非侵入性和高分辨率的特性，徹底改變了眼科和視覺科學領域，成為眼科組織斷層成像領域的重要診斷工具之一[14-16]。OCT技術在活體人眼角膜、視網膜組織結構成像中已得到廣泛應用[17-20]。隨著光電技術的不斷改進，超高分辨率光學相干斷層成像儀(ultra-high resolution optical coherence tomography，UHROCT)已經實現了微米級的軸向分辨率[21-22]。UHROCT在眼表組織的成像性能可以對淚膜[23]、角膜主要結構成像[24]，以及各層組織厚度測量，如角膜上皮層/上皮細胞，腎小球膜、基質、角膜后彈力層和內皮[25]，這可以幫助臨床醫生更好地診斷和監測眼部表面病理和疾病，包括角膜炎[25-26]、圓錐形角膜[27]、眼部表面腫瘤[28]等。

對于眼表疾病，除組織結構的改變外，炎癥還會引起眼微血管系統的改變，引起血管擴張、通透性增加、血流增加等一系列與病變嚴重程度有關的血管功能性變化[5-6]。OCT血管造影等技術已被應用于前段血管成像[29-30]，但只能提供形態學信息，缺乏提供血流速度等定量功能參數的功能。為測量球結膜血管的血流速度和評估其網絡的復雜性，本團隊開發了功能裂隙燈生物顯微鏡，實現結膜血管網絡成像和高分辨率結膜血流視頻成像[10,31]。通過定制的軟件，可以對圖像和視頻進行處理，得到血管直徑、復雜程度等形態學參數，以及血流速度等功能參數。上述方法已經在健康受試者以及眼表損傷和炎癥等疾病患者的臨床研究[31-35]中得到驗證，被證明是對球結膜微血管系統進行成像和評估的一種非常簡單且成本效益更高的替代方法。

聯動的PLC、2套步進電機、1塊觸摸屏、1套鎖付機及相關的外圍機械組件構成。PLC1為主控制器， 實現自動裝料、自動安裝螺絲等功能；PLC2為從站控制器，實現工作臺前后、左右移動到預訂安裝位置的功能。通過人機界面(觸摸屏)來實時查看系統工作狀態，修改螺絲安裝位置等相關參數。

以指標體系中的一級指標為例來進行安全管理評價分析，邀請青島理工大學6位專家進行賦權打分.在打分時為了使數據較規范，要求打分取值在在0～10之間且為0.5的整數倍.打分數據如表 4 所示.

圖2顯示了多模態眼表成像系統在健康受試者上獲得的實驗結果。圖2C為健康角膜的UHR-OCT圖像。最佳聚焦位置在角膜的中部，因此可以以最高的靈敏度對全角膜進行成像。在UHR-OCT圖像放大區域(圖2D)，角膜主要層結構如上皮層(EP)、前彈力層(BL)、基質層(ST)、內皮層(ED)清晰可見。圖2F為健康受試者結膜血管網絡的靜態圖像。圖2G，H顯示了使用圖像分析軟件從圖2F處理得到的骨架化網絡。計算健康受試者微血管網絡的分形維數為：單重分形Dbox=1.56，多重分形D0=1.49(表1)。圖2E是從健康受試者的一段結膜血流視頻片段中截取的靜止結膜血管圖像。通過軟件計算血流動力學定量結果是：平均血管直徑D=17.2 μm，軸向血流速度平均值Va=0.25 mm/s，和血流量平均值Q=59.8 pl/s(表1)。

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本研究通過在數碼裂隙燈生物顯微鏡平臺上集成自主開發的UHR-OCT和微血管成像系統，開發了一套全新的多模態非接觸的眼表多功能成像平臺，為眼科臨床眼表疾病檢查提供結構和功能信息。

1 材料與方法

1.1 成像裝置

通過在1 名健康受試者和1 名角膜炎患者進行在體成像實驗，初步驗證了多模態眼表成像系統的性能及可行性。實驗均已獲得受試者知情同意，實驗程序遵循赫爾辛基宣言原則，按照臨床研究設計方案進行(臨床批件倫理號：2017KYPJ104)。首先對每位受試者進行正常的裂隙燈檢查。然后，依次對角膜中央/角膜損傷區和球結膜區進行OCT成像和微血管成像。最后，對角膜炎患者行裂隙燈熒光染色成像。

圖1 系統結構原理圖Figure 1 Schematic of the eye imaging system

1.2 微血管圖像分析

在本研究中，OCT成像以24 000 A-line/s的掃描速率記錄圖像，獲得橫向掃描范圍為6 mm的OCT斷層圖像。球結膜血管成像時，首先在數碼相機的單圖模式下通過設置裂隙燈顯微鏡的放大倍率為16倍，對應的成像視場約為18×12 mm2，圖像大小為5 184×3 456像素。然后，微血管成像在佳能60D攝像機的電影剪輯功能下，以60幀/s的速度拍攝球結膜血流視頻片段，進行血流動力學分析，裂隙燈顯微鏡放大率設置為2 5 倍，60D相機長焦效應放大率為7.5倍，成像視場約為1.15×0.86 mm2，圖像尺寸為640×480像素。為了測量的準確性，需要從多個區域記錄一個受試者球結膜上的5個視頻片段，在每個成像位置記錄1～2 s。采集到的圖像和視頻片段，通過自主開發的軟件進行處理得到最終的結果。

2 結果

多模態眼表成像系統的原理如圖1所示。多模態系統集成了裂隙燈顯微鏡、自主研發的OCT模塊和眼微血流成像模塊。眼微血流成像系統采用了裂隙燈顯微鏡的光源和光學系統，數碼相機通過裂隙燈固有的相機端口連接到裂隙燈光路。為提高結膜血管網絡和血流視頻的圖像質量，在裂隙燈光源光路中加裝濾光片提高紅細胞顯示強度，無需對裂隙燈進行額外的修改或轉接適配器。為獲得合適的成像視野，裂隙燈內置光學放大率設為25倍(由放大率表盤設定)，血流成像采用的數碼相機放大率為7.5倍(由佳能EOS 60D相機功能設定)，總成像放大率可達約187.5倍。UHR-OCT模塊是基于超寬譜光源(MT-850-HP-I，Superlum)的OCT系統。SLD光源發出的光經過隔離器、衰減器后，進入分光比為25:75的光纖耦合器，入射光按照比例分入樣品臂和參考臂。為匹配偏振態及色散，參考臂和樣品臂均裝有偏振控制器及相同的光學元件。在樣品臂，準直后的光經過二維掃描振鏡和聚焦透鏡，通過45°安裝在在裂隙燈成像鏡頭前的二向色鏡反射入人眼。照射在人眼上的入射光的功率調節到750 μW，低于ANSI(美國眼科標準-眼科儀器的光危害保護)規定的最大允許暴露量[46-47]。進入參考臂的光，經準直后通過中性密度濾波器、聚焦透鏡后對準平面反射鏡。參考臂的光路長度與樣品臂的光路長度匹配。從樣品臂上的眼睛和參考臂上的鏡子反射的光被反射回光纖耦合器，包含組織信息的光信號隨后進入OCT的光譜儀。光譜儀由準直透鏡、光柵，圖像放大透鏡和線陣CCD相機組成。CCD相機信號通過圖像采集卡傳輸進入計算機。

微血管成像模塊獲取的結膜血管網絡圖像和動態血流視頻，需進一步應用成像算法處理，以提取定量的血流形態學和血流動力學功能參數。圖像處理軟件的開發已在之前的文獻中敘述[31-32]。對于結膜血管網絡圖像，首先，通過自適應直方圖均衡化來提高圖像質量，然后通過減去背景圖像來進一步增強圖像質量；然后，將增強后的圖像轉換為二值圖像，利用骨架化算法得到網絡骨架；最后，對血管骨架圖像進行分析，計算分形維數復度，提取反應血管網復雜度的分形維數單分形值(Dbox)和反應血管網密度的多重分形(D0)值，用于評價血管密度和復雜性。對于結膜血流影像，首先采用基于球結膜時空圖像的運動校正算法，對眼球運動進行補償，得到配準圖像。在對血管圖像進行增強和分割后，利用多幀圖像的均值，通過計算血管信號輪廓的半高寬(full width at half maxima，F WHM)來測量血管直徑(D，μm)。通過分析紅細胞的運動，定量結膜血流動力學參數，直接測出軸向血流速度(Va，mm/s)，以此計算出截面血流速度，截面血流速度乘以血管橫截面積(假設血管為圓形截面，由血管直徑計算得出)獲得血流量(Q，pl/s)[48]。

2.1 健康人

目前，眼科疾病的診斷和治療評估通常是基于裂隙燈、OCT等多類傳統結構成像設備，結合眼表熒光染色等多種技術，獲得的單模態的組織信息，再通過醫生進行綜合判斷。能夠同時提供多模態成像和全面診斷信息的一體成像系統逐步成為臨床的需求。提高系統分辨率，提供功能成像能力，實現眼科疾病的準確早期診斷和定量分類，是當今眼科影像學及成像設備的發展趨勢。多模態一體成像系統不僅可以減少患者從一個檢查設備轉到另一個檢查設備的耗時，提高醫療機構的檢查效率，而且可以減少檢查設備占據的空間和設備投資。目前，國內外研究人員已經開發了多種多模態系統來結合多種成像模態的優點用于人眼成像[36-45]，但其中大多數集中應用在后段成像[36-40]，用于人眼前段成像較少。另外，有研究證明將OCT系統集成到裂隙燈顯微鏡中進行前后段成像以提高檢查效率[41-42]，OCT和角膜地形圖結合的多模態系統已被用于前段生物測量，并應用于圓錐角膜的結構成像[43-44]。

上個世紀80年代初，馬大正在翻閱丹麥探險家亨寧·哈士綸《蒙古的人和神》(英文版)時，看到有一幅渥巴錫畫像的插圖，印象極深。在馬大正和馬汝珩教授合著1984年出版的《厄魯特蒙古史論集》和1991年出版的《漂落異域的民族——17至18世紀的土爾扈特蒙古》書中均收選了這幅畫像。但我們和讀者一樣，對這幅渥巴錫畫像存在疑惑，畫中人物頗顯蒼老，至少有50歲以上，需知渥巴錫逝世時才31歲呀！牙含章《達賴喇嘛傳》一書中收了一幅蒙古族首領固始汗(即顧實汗)，說明是“布達拉宮壁畫”。兩幅畫像真有極大相似之處，所以有的學者提出：亨寧·哈士綸將顧實汗的畫像錯當成渥巴錫畫像了。

2.2 角膜炎患者

圖3顯示了多模態眼表成像系統對角膜炎患者的實驗結果。眼外觀裂隙燈成像可見明顯的炎性病變。角膜熒光素染色成像突出顯示了病變在眼表的位置、大小和邊界。UHR-OCT圖像顯示：病灶在靠近角膜頂端邊緣的區域呈高反射結構，角膜病灶清晰可見，侵潤角膜上皮層、前彈力層和基質層。計算角膜炎患者微血管網的分形維數為：單分形Dbox=1.65，多重分形D0=1.69(表1)。從角膜炎患者的結膜血流視頻片段中截取到的靜止的結膜血管圖像中，放大區域紅色箭頭所指顯示的是紅細胞簇。經圖像處理軟件計算，角膜炎患者的血流動力學結果為平均血管直徑D=23.0 μm，軸向血流速度Va=0.58 mm/s，血流量Q=194 pl/s(表1)。

圖2 健康受試者多模態成像Figure 2 Experimental results of the healthy subject

圖3 角膜炎患者多模態成像Figure 3 Experimental results of the keratitis patient

表1 血流形態學及動力學參數對比Table 1 Comparison of the quantitative vessel parameters

3 討論

本研究首次在傳統的裂隙燈顯微鏡系統上集成了UHR-OCT模塊和微血管成像模塊，開發了一種能夠進行眼前段結構和功能成像的非接觸多模態成像平臺。成像平臺可實現：1)利用UHR-OCT模塊實時人眼角膜/結膜高分辨率OCT圖像；2)利用微血管成像模塊進行結膜血管網絡成像和高分辨率結膜血流成像；3)使用裂隙燈顯微鏡模塊進行熒光素染色和裂隙燈成像。針對多模態成像系統獲取的血流圖像，自主開發了圖像分析軟件來實現血管參數的定量分析。通過在健康的人體受試者和角膜炎患者進行的在體成像測試，證明了多模態系統的可行性。UHR-OCT模塊用于高分辨率角膜結構成像，角膜組織軸向分辨率為約為2 μm。微血管成像模塊橫向分辨率約為3.5 μm，放大倍數達約為187.5倍，可分辨結膜微血管系統和移動的紅細胞簇。在體成像測試已經成功地證明了該系統的可行性，顯示了其在眼科臨床應用的潛力。通過自主開發的圖像分析件，進一步獲得定量血流形態學和血流動力學參數，初步認識到健康受試者與角膜炎患者在血管密度、復雜性、血管直徑和血流率方面的差異，符合炎癥后血管擴張、扭曲和血流增加的臨床表現[5-6]。

雖然多種多模態的眼科成像系統已被用于人眼成像，但一般只用于眼后段成像。與目前傳統的眼科成像方式相比，我們自主研發的多模態眼前成像不僅可以通過UHR-OCT模塊提供高于商業設備(軸向分辨率一般為5 μm)的結構信息，而且可以通過微血管成像模塊提供球結膜血管的功能信息，具有多模態、多維度的成像功能，有望幫助眼科醫生對眼前病變進行更全面的評估、更準確的診斷和定量分類。

未來的系統改進工作將在UHR-OCT成像速度，實現實時三維成像等方面提升，另外，球結膜血管的形態學和血流動力學參數經驗證可以與眼表疾病炎癥的狀態相關，還需要進行大規模臨床研究全面描述這些定量參數之間的關系。此外，由于人工智能技術在眼科圖像自動分析及眼科疾病診斷中得廣泛應用[49-50]，多模態眼前段成像系統還可以為多模態人工智能應用提供圖像數據支持。