全視場(chǎng)光學(xué)相干層析技術(shù)的角膜高分辨率成像

肖鵬，Viacheslav Mazlin，袁進(jìn)

(1.中山大學(xué)中山眼科中心，廣州 510060；2.朗之萬(wàn)研究所，法國(guó) 巴黎)

角膜是位于眼球最前端的光學(xué)透明組織，是清晰視覺(jué)形成的前提與基礎(chǔ)。角膜疾病是全球主要的致盲性眼病，每年造成150萬(wàn)～200萬(wàn)人失明，且90%以上的受影響人口生活在發(fā)展中國(guó)家[1-3]。角膜疾病嚴(yán)重影響人民群眾的眼健康和生活質(zhì)量，是涉及民生的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。角膜成像技術(shù)通過(guò)提供角膜的結(jié)構(gòu)和功能圖像，能夠幫助臨床醫(yī)生獲取更全面的疾病信息，在角膜疾病的診斷和治療中具有無(wú)可取代的作用。發(fā)展高分辨率活體角膜成像技術(shù)，對(duì)角膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行更精準(zhǔn)有效的分析，是眼科學(xué)及影像學(xué)交叉領(lǐng)域的重要研究問(wèn)題。

目前，應(yīng)用在臨床活體角膜檢測(cè)的傳統(tǒng)成像技術(shù)主要有裂隙燈生物顯微鏡(slit lamp biomicroscopy，SLB)，活體共聚焦顯微鏡(in vivo confocal microscopy，IVCM)和光學(xué)相干層析技術(shù)(optical coherence tomography，OCT)等。SLB是角膜臨床活體檢測(cè)時(shí)最常使用的非接觸性成像設(shè)備，通過(guò)調(diào)節(jié)焦點(diǎn)和光源寬窄，形成“光學(xué)切面”，能用于觀察表淺及深層的角膜病變。但是受制于光學(xué)成像原理和放大倍率，SLB的成像分辨率有限，無(wú)法觀測(cè)到角膜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[4]。IVCM是一種逐點(diǎn)掃描并利用空間針孔調(diào)制來(lái)去除樣品非焦點(diǎn)平面的散射光以提高光學(xué)分辨率和視覺(jué)對(duì)比度的臨床角膜活體成像方法，它具有的微米級(jí)別高平面分辨率足以觀察角膜組織中的單個(gè)細(xì)胞甚至細(xì)胞核[5-7]。然而，受設(shè)備掃描速率和眼球運(yùn)動(dòng)的限制，IVCM在活體角膜高分辨率成像中的成像視野非常有限，一般不超過(guò)400 μm×400 μm。OCT是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型斷層成像技術(shù)[8-9]。它利用不同組織結(jié)構(gòu)對(duì)光的反射率不同，使用近紅外弱相干光照射待測(cè)組織，依據(jù)光的相干性產(chǎn)生干涉來(lái)獲得組織的斷層圖像，從而獲得組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)。OCT具有非接觸性、快速成像、高探測(cè)靈敏度等特點(diǎn)，在角膜疾病的基礎(chǔ)研究、臨床診斷、鑒別診斷和療效跟蹤觀察[10-14]等方面被廣泛應(yīng)用。然而，由于傳統(tǒng)OCT是通過(guò)檢測(cè)沿光軸景深各點(diǎn)反射的信號(hào)來(lái)獲取圖像，為保證足夠的成像深度，OCT一般采用數(shù)值孔徑較小的顯微物鏡，因此傳統(tǒng)OCT在提供具有高軸向分辨率的橫斷面圖像的同時(shí)，無(wú)法提供具有高平面分辨率的細(xì)胞平面(en face)結(jié)構(gòu)圖像[9]。

全視場(chǎng)光學(xué)相干層析技術(shù)(full-field optical coherence tomography，F(xiàn)FOCT)是OCT的一種變體。FFOCT使用寬帶空間非相干光源(LED等)，通過(guò)光學(xué)相干切片功能檢測(cè)給定深度相干平面的反射信號(hào)，利用面陣相機(jī)(CCD/CMOS camera)直接獲得大視野的二維平面圖像，通過(guò)對(duì)樣本沿深度進(jìn)行掃描獲取三維圖像[15-16]。FFOCT成像技術(shù)結(jié)合了傳統(tǒng)OCT的非接觸三維成像、大成像視野和高軸向分辨率的優(yōu)勢(shì)以及IVCM的高平面分辨率的特點(diǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展和對(duì)原始儀器的改進(jìn)，F(xiàn)FOCT已經(jīng)顯示出了超越很多飛秒激光系統(tǒng)的分辨能力[17]。前期研究[18]結(jié)果證明：由于使用了空間非相干光源，F(xiàn)FOCT的空間分辨率不受幾何相差的影響，而只降低系統(tǒng)的成像信噪比。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及影像技術(shù)的發(fā)展，眼科學(xué)基礎(chǔ)研究和角膜疾病的臨床診療對(duì)角膜成像技術(shù)的需求正從傳統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)成像向高分辨率結(jié)構(gòu)及功能成像過(guò)渡。將FFOCT應(yīng)用到活體角膜成像中，將能實(shí)現(xiàn)角膜的非接觸性、大成像視野、高分辨率細(xì)胞成像，提供更豐富、更全面的高分辨率角膜結(jié)構(gòu)和功能的信息，使醫(yī)生在角膜疾病的精確診斷、精準(zhǔn)治療及深入的病因病理研究方面的追求得以更好的實(shí)現(xiàn)。

本研究針對(duì)當(dāng)前角膜成像的重大需求及高分辨率活體成像技術(shù)研究的發(fā)展趨勢(shì)，創(chuàng)新性設(shè)計(jì)并構(gòu)建活體角膜成像高分辨率FFOCT系統(tǒng)，采用高數(shù)值孔徑顯微物鏡及高速面陣相機(jī)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞級(jí)別成像分辨率及大成像視野。通過(guò)對(duì)健康人眼活體角膜進(jìn)行高分辨率FFOCT成像，驗(yàn)證其臨床應(yīng)用價(jià)值，為開(kāi)發(fā)新一代活體高分辨率角膜成像平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

為驗(yàn)證FFOCT系統(tǒng)在活體人眼角膜成像中的質(zhì)量，我們使用設(shè)備對(duì)1位27歲健康男性志愿受試者的角膜進(jìn)行了活體角膜FFOCT成像實(shí)驗(yàn)。受試者自愿簽署知情同意書(shū)，所有程序符合赫爾辛基宣言(1983年)。本研究?jī)?nèi)容已獲得法國(guó)人事保護(hù)委員會(huì)CPP(Comité de Protection de Personnes) Sud-Est III de Bron和國(guó)家藥品和健康產(chǎn)品安全局ANSM(Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des Produits de Santé)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2019-A00942-55)。FFOCT成像實(shí)驗(yàn)前，對(duì)受試者進(jìn)行了包括裂隙燈觀察、眼壓測(cè)量等常規(guī)的眼科檢查。FFOCT成像時(shí)，受試者將下頜固定于頜托上，上額緊貼額托，非成像眼注視視標(biāo)，保持穩(wěn)定。通過(guò)調(diào)節(jié)設(shè)備高度及成像位置，分別對(duì)受試者角膜中央各深度進(jìn)行FFOCT圖像采集。相機(jī)采集頻率設(shè)定為550 fps，每個(gè)成像深度通過(guò)雙相位調(diào)制模式采集10張F(tuán)FOCT圖像。完成采集后，10張F(tuán)FOCT圖像通過(guò)ImageJ的圖像配準(zhǔn)插件[19]進(jìn)行眼動(dòng)導(dǎo)致的平面抖動(dòng)配準(zhǔn)、疊加平均后獲得最終的活體角膜FFOCT圖像。為了和所采集FFOCT影像作對(duì)比，我們利用接觸式IVCM設(shè)備(HRT II with Rostock cornea module;Heidelberg Engineering，GmbH)采集了受試者角膜中央不同深度的IVCM影像。

1.2 方法

1.2.1 FFOCT 活體人眼角膜成像系統(tǒng)光學(xué)設(shè)計(jì)

如圖1 所示，F(xiàn)FOCT活體人眼角膜高分辨率成像系統(tǒng)是基于林尼克干涉儀的顯微鏡成像系統(tǒng)。系統(tǒng)設(shè)計(jì)使用中心波長(zhǎng)為850 nm發(fā)光二極管(Light-emitting Diode，LED，M850LP1，Thorlabs，USA)作為空間非相干寬帶光源。LED的光穿過(guò)非球面聚光透鏡后由立方體分光器以50:50的相等分光比分別照入FFOCT系統(tǒng)的樣本臂(Sample arm)和參考臂(Reference arm)。在樣本臂和參考臂中，光均通過(guò)相同的顯微鏡物鏡分別聚集在人眼角膜和反射鏡上。使用數(shù)值孔徑NA=0.3的干燥顯微物鏡(Olympus，Japan)，在非接觸成像方式下提供1.7 μm的理論橫向分辨率(瑞利標(biāo)準(zhǔn)，Rayleigh Criterion)。參考臂反射鏡安裝在壓電制動(dòng)器(piezoelectric transducer，PZT)上。系統(tǒng)樣本臂中從人眼角膜不同深度向后散射的光信號(hào)和參考臂中反射鏡反射的光信號(hào)由立體分光器重新組合通過(guò)相機(jī)聚焦透鏡(f=250，Thorlabs，USA)最后由大滿阱容的CMOS面陣相機(jī)(Q-2A750-CXP，Adimec，Netherlands)檢測(cè)成像。

圖1 FFOCT活體人眼角膜高分辨率成像系統(tǒng)光路設(shè)計(jì)圖Figure 1 Schematic of the in vivo human corneal imaging FFOCT system

1.2.2 FFOCT 系統(tǒng)光照安全評(píng)估

FFOCT系統(tǒng)將采用的是近紅外光源，中心波長(zhǎng)為850 nm。由于視網(wǎng)膜對(duì)近紅外光波的敏感度低，患者可以輕松地觀察到光照但不會(huì)造成對(duì)視網(wǎng)膜的光化學(xué)損傷(Photochemical damage)。針對(duì)我們系統(tǒng)所設(shè)計(jì)使用的光源和照明模式，基于眼科設(shè)備光照安全標(biāo)準(zhǔn)(美標(biāo)ANSI Z80.36-2016)，即使考慮長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)照明模式下，在眼底產(chǎn)生的視網(wǎng)膜照射量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的最大允許照射量(maximum permissible exposures，MPEs)：

同樣對(duì)于角膜的照射量及時(shí)考慮連續(xù)照明的模式，也是低于標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的MPEs的：

而為了提高患者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的舒適性，系統(tǒng)采用的照明模式為均勻的 脈沖調(diào)制模式。在相機(jī)運(yùn)行頻率550 fps的情況下，最終平均10張平面圖來(lái)獲得最終FFOCT圖像，脈沖時(shí)間34 ms，暫停時(shí)間1 000 ms的調(diào)制模式。大大降低光照對(duì)角膜及視網(wǎng)膜的照射量，增加系統(tǒng)的光照安全性。

1.2.3 雙相位調(diào)制FFOCT 活體角膜圖像處理

在FFOCT系統(tǒng)中使用的寬帶空間非相干光源保證了系統(tǒng)的干涉僅僅發(fā)生于角膜中來(lái)自相干平面內(nèi)的散射光信號(hào)。如圖2所示，為了提取相干平面內(nèi)的干涉信號(hào)并剔除不需要的非相干部分，系統(tǒng)采用了雙相位調(diào)制(two-phase modulation)方案，利用位于參考臂反射鏡后PZT對(duì)參考臂光程引入相位差等于的光程步進(jìn)調(diào)制，同時(shí)CMOS相機(jī)進(jìn)行同步圖像采集原始圖像I1，I2：

為提高圖像質(zhì)量，在同一成像深度采集處理多張平面圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行平均處理以獲得更好的最終FFOCT圖。在活體角膜成像中，為了提高系統(tǒng)成像幅頻，改善眼動(dòng)對(duì)成像質(zhì)量的影響，高速CMOS相機(jī)的采樣輻頻為550 fps。對(duì)眼球運(yùn)動(dòng)造成多張圖像之間的成像位置的微小差異，采用圖像組的互相關(guān)處理，完成多張圖像的位置的配準(zhǔn)，最終進(jìn)行平均疊加以提高FFOCT圖像的信噪比。

圖2 FFOCT雙相位調(diào)制圖像處理原理圖Figure 2 FFOCT two-phase modulation image processing principle

2 結(jié)果

FFOCT活體角膜圖像能清楚分辨包括淚膜、角膜上皮層、基底下神經(jīng)叢神經(jīng)纖維、角膜基質(zhì)層基質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)、角膜內(nèi)皮層內(nèi)皮細(xì)胞等正常角膜結(jié)構(gòu)(圖3)。FFOCT上層角膜影像中，基底下神經(jīng)纖維表現(xiàn)為高反射線型，同其在IVCM中的影像表現(xiàn)相似(圖3A)；FFOCT可以分辨出角膜上皮層結(jié)構(gòu)，但是，由于淚膜及基底下神經(jīng)叢結(jié)構(gòu)的高反射信號(hào)干擾，F(xiàn)FOCT影像暫無(wú)法區(qū)分角膜上皮鱗狀細(xì)胞、翼狀細(xì)胞及基底細(xì)胞結(jié)構(gòu)。FFOCT在中層角膜的影像清晰的顯現(xiàn)出角膜基質(zhì)層的基質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及基質(zhì)層神經(jīng)節(jié)連接多跟神經(jīng)纖維(圖3B)。FFOCT深層角膜影像中，可見(jiàn)深層角膜基質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及角膜內(nèi)皮高反射信號(hào)；從放大區(qū)域的FFOCT角膜內(nèi)皮影像中，可以清楚分辨健康角膜六邊形內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的緊密排布(圖3C)。

圖3 FFOCT活體健康人眼角膜圖像Figure 3 FFOCT image of in vivo healthy human cornea

3 討論

本文創(chuàng)新性設(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于FFOCT的高分辨活體人眼角膜成像系統(tǒng)，并對(duì)健康人眼角膜進(jìn)行了成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其性能。針對(duì)FFOCT系統(tǒng)成像速度及成像質(zhì)量對(duì)樣本運(yùn)動(dòng)的敏感性問(wèn)題，采用高數(shù)值孔徑干燥顯微物鏡及高速面陣相機(jī)，提高系統(tǒng)成像速度，改善活體成像時(shí)眼動(dòng)對(duì)成像質(zhì)量影響，實(shí)現(xiàn)非接觸成像方式下獲取活體人眼角膜的細(xì)胞級(jí)別平面分辨率FFOCT影像。FFOCT活體人眼角膜成像系統(tǒng)的平面分辨率為1.7 μm，和目前臨床使用的角膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像技術(shù)IVCM相當(dāng)。但是與IVCM相對(duì)局限的成像視野(400 μm×400 μm)相比，F(xiàn)FOCT的成像視野達(dá)到1.26 mm×1.26 mm，能夠一次性獲得更大范圍內(nèi)的角膜高分辨率結(jié)構(gòu)信息。此外，F(xiàn)FOCT的非接觸成像方式，相比IVCM接觸性的成像方式且成像前需對(duì)病患進(jìn)行眼表麻醉，降低了成像過(guò)程中角膜感染以及角膜上皮損傷的風(fēng)險(xiǎn)，在一些特殊場(chǎng)景，如角膜疾病檢測(cè)和術(shù)后評(píng)估中具有一定的優(yōu)勢(shì)。針對(duì)后期大范圍的臨床應(yīng)用驗(yàn)證，該FFOCT高分辨率活體人眼角膜成像系統(tǒng)仍需要進(jìn)一步優(yōu)化成像采集模式，減少單張圖像所需疊加次數(shù)，提升成像速度以期實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的三維成像，在提供高分辨率平面信息的同時(shí)，增加高分辨率縱向結(jié)構(gòu)信息。