藍莓-酸櫻桃復合果酒發酵工藝優化

李廣偉，楊春曉，于 杰，劉 盛，張卓睿*

（1.山東濰坊科技學院經濟管理學院，山東 濰坊 261000；2.北華大學林學院，吉林 吉林 132013）

藍莓（Semen trigonellae）是杜鵑花科越橘屬植物[1]，屬多年生灌木小漿果果樹，其果實營養價值較高，富含維生素A（vitamin A，VA）[2]、維生素E（vitamin E，VE）[3]、花青素[4]、酚酸[3]、熊果酸[3]、類黃酮[3]和超氧化物歧化酶[5]等天然活性成分，具有改善視力[6]、抗氧化[7]、增強免疫力[8]、抑菌[9]和保護心腦血管[10-11]等功效，是聯合國糧食及農業組織（food and agriculture organization of the united nations，FAO）推薦的五大營養健康水果之一，被譽為“漿果之王”[2-4]。酸櫻桃（Cerasus valgarisMill.）是薔薇科李屬經濟樹木[12]，其果實為核果，含有多糖、維生素和礦物質等營養物質，尤其是原花青素[13]、花色苷[14]、褪黑激素[15]、槲皮素[12]等功效成分含量較高，具有清除自由基[14]、抗癌[12]、改善睡眠[16]、降低血糖[17]等藥理作用。

果酒是將破碎、壓榨后的水果經發酵等工藝制成的一類飲料酒，酒精度低，一般為7%vol～18%vol[18-19]。果酒中富含氨基酸、維生素、多糖、多酚等多種活性成分，營養價值較高，可起到控制人體內膽固醇和促進血液循環、預防心腦血管疾病，調節新陳代謝，抗衰老等功效[20]。近幾年，果酒需求量逐年增大，研制果酒新品種成為食品研究領域的新熱點[21]。

目前已有利用藍莓釀制果酒的相關報道。劉彩婷[22]通過對比18種商業酵母的發酵過程，篩選出了最適宜藍莓酒的JK10酵母，并確定了藍莓酒的最佳發酵工藝條件。胡佳星等[23]對野生藍莓果酒的發酵工藝進行了優化，并采用最佳發酵工藝條件制備果酒的酒精度為4.2%vol，感官評分為87分。李安等[24]研究了發酵及貯藏條件對藍莓果酒中花色苷的影響。關于櫻桃果酒方面的研究也較多。李志友等[25]對櫻桃果酒的釀造工藝進行了優化，采用最佳的工藝條件所得櫻桃果酒口味醇正，酒精度為10%vol～11%vol。雷丹等[26]通過試驗研究，制得了酒精度為10.8%vol、口感較好的川西高原野櫻桃果酒。張秀艷等[27]改良了釀造工藝，使得櫻桃果酒的理化指標和感官指標有了較大提高。彭璐等[28]篩選出的產香酵母，能使櫻桃酒增加20種香氣成分。

基于藍莓和酸櫻桃的營養特色，本研究以藍莓、酸櫻桃為原料制備藍莓-酸櫻桃復合果酒，以初始糖度、發酵溫度和發酵時間為自變量，以酒精度為響應值，通過單因素試驗和響應面試驗優化藍莓-酸櫻桃復合果酒的發酵工藝條件，以期豐富果酒的產品種類，增加兩種水果的應用途徑，提高食用附加值，克服其供應季短、不耐運輸和貯藏的局限性，為推進兩種水果的種植業發展和產業化進程提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸櫻桃：采于吉林省蛟河試驗林場，預冷（-20 ℃預冷24 h）后放入冰箱內冷凍（-80 ℃）貯藏；藍莓：采于吉林省臨江藍莓基地，預冷（-20 ℃預冷24 h）后放入冰箱內冷凍（-80 ℃）貯藏。

1.1.2 試劑

安琪果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蔗糖（優級純）：市售；亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

SPX-2500S-Ⅱ型生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市科技儀器有限公司；LDZX-40 Ⅱ型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；FA2004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；精密酒精計：河間市振巖儀器儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 藍莓-酸櫻桃復合果酒工藝流程及操作要點

操作要點：

藍莓、酸櫻桃的預處理：去除藍莓果和酸櫻桃果中的雜質，以及一些有病蟲害和霉爛的壞果，將挑選出來的果實沖洗干凈，瀝去水分，酸櫻桃去核。

混合、破碎：將藍莓與去核后的酸櫻桃按配比1∶1（g∶g）混合，充分破碎、攪拌，使兩種果漿能均勻的混合在一起。

成分調整、滅菌：按照試驗所確定的添加量，向混合果漿中加入23%蔗糖，同時，為了起到殺菌作用，按混合果漿總量的0.04%加入NaHSO3，在60～65 ℃條件下巴氏殺菌25～30 min。

酵母活化：將安琪果酒酵母按料液比1∶10（g∶mL）加入到2%蔗糖溶液中，在35 ℃條件下活化30 min[29]。

發酵：將活化好的果酒酵母按0.06%接種量接種到滅菌后的藍莓、酸櫻桃復合果漿中，攪拌均勻后，在22 ℃條件下發酵13 d，每隔24 h檢測一次發酵液的初始糖度，當初始糖度降至6%以下時，停止發酵。

酒渣分離和后發酵：將發酵好的藍莓-酸櫻桃酒液用濾布過濾，過濾出的酒液在18 ℃條件下后發酵20 d，然后倒罐、分離酒腳。

陳釀、成品：在17～18 ℃條件下陳釀70～80 d，期間進行倒罐、下腳澄清等處理，陳釀后的酒液用300目濾布過濾，即得藍莓-酸櫻桃復合果酒成品。

1.3.2 藍莓-酸櫻桃復合果酒發酵工藝優化單因素試驗

采用單因素輪換法，以酒精度和感官得分為評價指標，分別考察藍莓與酸櫻桃的質量比（4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4（g∶g））、初始初始糖度（17%、19%、21%、23%、25%）、酵母接種量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、發酵溫度（18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃）、發酵時間（7 d、9 d、11 d、13 d、15 d）對藍莓-酸櫻桃復合果酒的影響。

1.3.3 藍莓-酸櫻桃復合果酒發酵工藝優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以發酵時間（A）、發酵溫度（B）和初始糖度（C）為試驗因素，以酒精度（Y）為響應值，進行3因素3水平的響應面試驗設計，因素與水平見表1。

表1 藍莓-酸櫻桃復合果酒發酵工藝優化響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of blueberry-sour cherry compound fruit wine

1.3.4 分析檢測

酒精度、總糖、總酸的測定采用國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法、直接滴定法及電位滴定法[30]；糖度的測定采用折光計法[31]。

1.3.5 感官評價

參照國標GB/T 32783—2016《藍莓酒》中感官評分要求[32]，結合藍莓-酸櫻桃復合果酒的特點，請10位專業人員從色澤、氣味、口感和狀態四個方面對復合果酒進行感官評價，滿分為100分，感官評分標準見表2。

表2 藍莓-酸櫻桃復合果酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of blueberry-sour cherry compound fruit wine

續表

1.3.6 數據處理

使用Excel 2010對單因素試驗結果進行數據分析和處理，所有數據均平行測定3次，結果以“平均值±標準偏差”表示。響應面試驗結果采用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據處理，所有數據均平行測定3次，結果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 藍莓-酸櫻桃復合果酒發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 藍莓與酸櫻桃最佳配比的確定

由表3可知，在藍莓和酸櫻桃質量比為4∶1～1∶4的范圍內，各樣品的酒精度在（9.1±0.14）%vol～（9.7±0.12）%vol之間，相差不大，說明藍莓和酸櫻桃不同配比對復合果酒的酒精度有一定的影響，但影響效果不顯著。當藍莓和酸櫻桃質量比在4∶1～1∶2時，酒精度呈增加趨勢，由于釀酒酵母適宜在pH 4左右的酸性環境中生長繁殖，而酸櫻桃中有機酸含量較高，所以隨著其添加量的增加，復合果酒的酒精度逐漸增大；當藍莓：酸櫻桃的質量比為1∶2時，酒精度達到最大值，為（9.7±0.12）%vol；之后再繼續增加酸櫻桃的添加量，酒精度降低至（9.5±0.13）%vol，究其原因可能是，加入過量的酸櫻桃會使復合果酒酸度低于適宜的范圍，不利于酵母發酵。通過感官評價，發現兩種水果的不同質量比，對復合果酒的口感影響較大，當藍莓酸櫻桃質量比超過1∶1時，復合果酒過酸，品嘗起來有明顯的刺口、尖銳感，口感變差。因此，綜合考慮復合果酒的酒精度和感官評價，確定藍莓和酸櫻桃的適宜質量比為1∶1，此時復合果酒的酒精度為（9.6±0.10）%vol，感官評分為（79.8±0.17）分。

表3 藍莓和酸櫻桃質量比對復合果酒品質的影響Table 3 Effect of mass ratio of blueberry and sour cherry on compound fruit wine quality

2.1.2 初始糖度的確定

由表4可知，隨著復合果汁中初始糖度在17%～23%范圍內的增加，復合果酒的酒精度逐漸增大，當初始糖度為23%時，酒精度達到最大值，為（10.6±0.12）%vol，此時復合果酒酸甜適口，具有明顯的果香和酒香，香氣協調，感官品質最好，感官評分為（78.1±0.21）分；之后初始糖度增加至25%時，酒精度有所下降。這是因為滲透壓增高而抑制了酵母的活性，導致發酵出現延滯，而且，由于發酵后的酒液中殘余糖分過高，復合果酒的口感偏甜，感官品質下降，評分降至（74.2±0.16）分。因此，確定藍莓-酸櫻桃復合果酒的適宜初始糖度為23%。

表4 初始糖度對復合果酒品質的影響Table 4 Effect of initial sugar content on compound fruit wine quality

2.1.3 酵母接種量的確定

由表5可知，隨著復合果酒酵母添加量在0.04%～0.06%范圍內的增加，酒精度急劇增大，這是因為果汁中糖分能充分轉化為酒精，當復合果酒酵母添加量為0.06%時，酒精度達到最大值（10.7±0.31）%vol，此時所得復合果酒呈寶石紅色，酸甜適口，果香和酒香協調，感官評分最高為（77.8±0.21）分，之后再繼續增加果酒酵母添加量至0.12%，酒精度出現下降趨勢。這是因為較多的糖分用于了微生物的生長繁殖，且易導致酵母細胞的過早老化、自溶等[33]，不利于發酵。由感官評分可知，酵母添加量過高，會使藍莓-酸櫻桃復合果酒的口感偏酸澀，甚至會產生苦味，感官評分逐漸降低。因此，確定藍莓-酸櫻桃復合果酒適宜酵母接種量為0.06%。

表5 酵母接種量對復合果酒品質的影響Table 5 Effect of yeast inoculum on compound fruit wine quality

2.1.4 發酵溫度的確定

環境溫度過低或過高都會影響果酒酵母的酶活性。由表6可知，隨著發酵溫度在18～24 ℃范圍內的增加，酒精度呈上升趨勢；在發酵溫度為24 ℃時，復合果酒的酒精度和感官評分最高，分別為（11.8±0.21）%vol、（78.5±0.42）分，果酒呈寶石紅色，果味和酒香協調，口感清爽，后味甘甜；當發酵溫度高于24 ℃時，酒精度有所下降。通過對各試驗組的感官評價發現，藍莓-酸櫻桃復合果酒的發酵溫度不適宜超過24 ℃，否則酒體會產生苦澀味，顏色變淡，同時果香也逐漸不明顯，感官品質下降。因此，確定藍莓-酸櫻桃復合果酒的適宜發酵溫度為24 ℃。

表6 發酵溫度對復合果酒品質的影響Table 6 Effect of fermentation temperature on compound fruit wine quality

2.1.5 發酵時間的確定

由表7可知，在藍莓-酸櫻桃復合果酒發酵過程中，發酵時間7～13 d是釀酒酵母生成酒精的旺盛時期，當發酵時間為13 d時，藍莓-酸櫻桃復合果酒的酒精度為（13.1±0.33）%vol，其香氣和諧，酒味醇厚，風味較好，感官評分為（81.4±0.27）分，繼續延長發酵天數至15 d，酒精度和感官評分略有下降。為了提高生產效率，確定藍莓-酸櫻桃復合果酒的適宜發酵時間為13 d。

表7 發酵時間對復合果酒品質的影響Table 7 Effect of fermentation time on compound fruit wine quality

2.2 藍莓-酸櫻桃復合果酒發酵工藝優化響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，選擇發酵時間（A）、發酵溫度（B）和初始糖度（C）為自變量，以酒精度（Y）為響應值，采用響應面法優化藍莓-酸櫻桃復合果酒的最佳發酵工藝條件，響應面試驗設計及結果見表8，方差分析結果見表9。

表8 藍莓-酸櫻桃復合果酒發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 8 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of blueberry-sour cherry compound fruit wine

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6軟件對結果進行回歸擬合，得到藍莓-酸櫻桃復合果酒的酒精度（Y）對發酵時間（A）、發酵溫度（B）和初始糖度（C）的二次多項回歸方程為：

由表9可知，所得回歸模型差異極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.586 0＞0.05），說明該模型擬合度良好，回歸方程具有統計學意義，用此方程代替真實點對試驗結果進行分析，誤差較小；變異系數（coefficient of variation，CV）＝0.68%＜1%，表明各試驗結果的精密度高，結果真實可靠[34]；決定系數R2=0.994 5，調整決定系數R2adj=0.987 4，表明方程擬合度高[35]。因此，可利用該模型分析和預測藍莓-酸櫻桃復合果酒的發酵工藝條件。

2.2.2 響應面交互作用分析

發酵溫度（B）、發酵時間（A）、初始糖度（C）交互作用對酒精度影響的響應面及等高線見圖1。

圖1 各因素交互作用對酒精度影響的響應面及等高線Fig. 1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content

根據各因素間的三維響應面圖和等高線圖判定各因素間交互作用的強弱，反映兩因素間的交互作用對響應值的影響大小。響應面圖曲面坡度幅度代表響應值的變化幅度，曲面坡度越陡，對響應值的影響越大，反之，則越小。由圖1可知，各因素交互作用的響應面曲線都出現了極大值，說明3個試驗因素所選擇的水平范圍合理，能反映出對酒精度的影響趨勢。結合方差分析可知，發酵時間與發酵溫度交互作用極顯著（P=0.001 1＜0.01），發酵溫度與初始糖度交互作用極顯著（P=0.009 1＜0.01），兩種交互作用的響應曲面都比較陡峭，對復合果酒酒精度具有極顯著的影響；發酵時間與初始糖度交互作用顯著（P=0.0490＜0.05），說明該交互作用雖然對酒精度有影響，但影響程度要低于前面兩種交互作用。

2.2.3 響應面模型驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得出藍莓-酸櫻桃復合果酒的最佳發酵工藝條件為發酵時間12.62 d，發酵溫度22.22 ℃，初始糖度22.67%，軟件預測的酒精度值為13.3%vol，為方便實際操作，將優化條件修正為發酵時間13 d，發酵溫度22 ℃，初始糖度23%，按照修正后的發酵工藝條件進行3次平行驗證試驗，實際測得藍莓-酸櫻桃復合果酒的酒精度實際平均值為（13.4±0.11）%vol，實際值與預測值相差不大，表明該工藝可行。

2.2.4 藍莓-酸櫻桃復合果酒理化指標測定結果

通過此工藝參數所得藍莓-酸櫻桃復合果酒酒體澄清透明，口感香醇，酒精度為（13.4±0.11）%vol，總糖（以葡萄糖計）含量為3.7 g/L，總酸（以乙酸計）含量為6.5 g/L，符合國標GB/T 32783—2016《藍莓酒》要求。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗優化得到藍莓-酸櫻桃復合果酒的發酵工藝條件為藍莓和酸櫻桃的質量比1∶1，酵母接種量0.06%，初始糖度23%，發酵時間13 d，發酵溫度22 ℃，在此優化條件下，所得果酒酒精度實際值為（13.4±0.11）%vol，酒體呈寶石紅色，澄清透明，口感醇厚，總糖（以葡萄糖計）含量為3.7 g/L，總酸（以乙酸計）含量為6.5 g/L，符合國標GB/T 32783—2016《藍莓酒》要求。