醬香型白酒大曲微生物研究進展

蔣倩兒，陳文浩，孫金沅*，劉 洋

（1.宜賓學院固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.北京工商大學中國輕工業釀酒分子工程重點實驗室，北京 100048；3.北京科技大學化學與生物工程學院，北京 100083）

中國白酒是以糧谷為原料，以大曲、小曲或麩曲以及酒母等為糖化發酵劑，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾而制成的蒸餾酒，是世界六大蒸餾酒之一[1]。醬香型白酒作為中國白酒的傳統典型酒種之一，具有醬香突出、幽雅細膩、回味悠長、空杯留香持久等特點，受到很多消費者青睞[2]。醬香型白酒釀造工藝獨特，整個生產周期需經歷二次投料，八輪次發酵，七次蒸酒，長期陳釀，精心勾兌而成[3]。高溫大曲作為醬香型白酒的微生物載體和糖化曲劑，為白酒的釀造提供了豐富的微生物菌株、獨特的醬香成分和前體物質，是形成醬香型白酒特有風味的關鍵因素[4-5]。高溫大曲發酵在生產過程中起著重要作用，其質量直接關系到白酒的生產和質量[6]。國內對于醬香型白酒微生物的研究多集中于功能微生物的研究、香味成分分析，以及篩選獲得相關功能性菌株用以提升醬香白酒的風味。

本文主要對醬香型白酒大曲微生物的多樣性分析、產香成分研究、酶活研究以及大曲微生物在醬香型白酒生產中應用的最新研究進展進行了論述，并對醬香型白酒大曲微生物未來的研究與利用提出了思考與展望，對增強白酒風味、提高白酒產量具有一定的意義。

1 醬香型白酒大曲微生物多樣性分析

白酒釀造是天然混合細菌固態發酵的過程，微生物貫穿整個過程。釀造微生物的群落結構和演替決定了代謝物的類型和數量，以及白酒中所含芳香物質的多樣性和組成，從而形成了特定的口味和白酒類型[7]。所以高溫大曲中的微生物多樣性分析對于醬香型白酒大曲微生物的進一步探究有很重要的作用。

在醬香白酒大曲生產中，溫度可達60 ℃以上，不同溫度階段微生物組成不同。在較低的溫度下，酵母菌、霉菌和某些細菌大量積累，產生較高水平的酶和其他代謝物，酶將系統中的蛋白質水解成各種氨基酸。這些酶和氨基酸也經過美拉德和其他化學反應，產生了有助于醬香風味的化合物。在較高的溫度下，只剩下耐熱菌和細菌，產生大量的代謝產物，可能發生復雜的反應，產生更多的風味物質[8]。醬香型白酒微生物物種豐富，主要包括酵母菌、細菌、霉菌、乳酸菌等。

1.1 醬香大曲中的細菌

醬香型白酒中的細菌種類較多，GAN S H等[9]分析了茅臺發酵劑的微生物群落組成和功能特征，揭示了茅臺成熟發酵劑的優勢菌群為鏈孢桿菌屬（Desmospora）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、海洋桿菌屬（Oceanobacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）和枝芽孢菌屬（Virgibacillus）。WANG Y等[10]采用Illumina MiSeq高通量測序技術對三種不同類型高溫大曲（白色大曲、黑色大曲和黃色大曲）的細菌多樣性進行了研究，發現在30個高溫大曲樣品中共鑒定出7個細菌門和262個細菌屬。高溫大曲樣品中的優勢細菌屬是熱放線菌（Thermoactinomyces）、葡萄球菌（Staphylococcus）、慢桿菌（Lentibacillus）、芽孢桿菌（Bacillus）、克氏桿菌（Kroppenstedtia）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、鏈霉菌（Streptomyces）和短桿菌（Brevibacterium）。三種不同類型高溫大曲的細菌群落結構差異顯著。白色大曲中的生物標志物是芽孢桿菌（Bacillus），黑大曲的生物標志物是葡萄球菌（Staphylococcus），馬賽菌屬（Massilia）是黃色大曲中的主要細菌，每個不同類型的高溫大曲細菌結構不同。正是細菌在大曲中的的動態演替，形成了最后特殊的白酒香味。

不同地區和不同生產工藝使發酵過程中微生物群落結構的演變發生差異，最終使白酒的質量不同，不同地區同一香型白酒的微生物區系存在很大差異[11]。北派醬香型白酒是中國醬香型白酒中特有的一種。不同于茅臺等南方醬香型白酒，北派醬香型白酒有其獨特的香味。JIANG Q等[12]基于高通量測序技術的微生物非培養方法，解析北派醬香型白酒高溫大曲制曲過程中微生物多樣性及其動態演替變化規律。結果表明在6個大曲樣品中，主要細菌類群為乳酸菌（Lactobacillus）、魏斯氏菌（Weissella）、芽孢桿菌（Bacillus）、代爾夫特菌（Delftia）、無色桿菌（Achromobacter）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、熱放線菌（Thermoactinomyces）、火山渣芽胞桿菌（Scopulibacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）和狹食單胞菌（Stenotrophomonas），并且發現在大曲生產過程中，這些微生物群落的結構和多樣性呈現動態演替。沈毅等[13]以醬香型郎酒大曲為研究對象，運用高通量測序技術解析其細菌菌落結構和多樣性，發現大曲中的主要優勢菌群包括高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、泛菌屬（Pantoea）、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和乳球菌屬（Lactococcus）等。

1.2 醬香大曲中的霉菌

醬香大曲中的霉菌能產生多種活性酶，對原料中淀粉、蛋白質等的降解具有重要作用，是醬香型白酒中的醬香風味的重要來源，其復雜的菌群多樣性結構和演替對白酒風味有重要影響。醬香型大曲中霉菌資源豐富，包括曲霉、青霉、毛霉等多種霉菌。傳統培養方法和高通量測序技術的結合讓人們對大曲中的霉菌有了更深刻的認識。孫利林等[14]采用微生物高通量測序分析技術，對醬香型白酒第四輪次酒曲進行真菌微生物多樣性和優勢種群結構變化分析，結果發現在酒曲中主要優勢菌有曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）。朱治宇等[15]對茅臺鎮醬香白酒7個主釀區釀造大曲中的霉菌進行解析，其中從大曲樣品中檢出68個屬，明確了曲霉（Aspergillus）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、紅曲霉屬（Monascus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、毛霉屬（Rhizomucor）等霉菌屬是醬香白酒釀造大曲中的優勢霉菌。班世棟等[16]采用傳統可培養技術從醬香型白酒大曲中分離得到曲霉（Aspergillus）、紅曲霉屬（Monascus）、毛霉屬（Mucor）、青霉屬（Penicillium）等19株霉菌。向玉萍等[17]利用純培養方法對5個醬香大曲樣品中的微生物進行培養，共分離篩選得到10個屬的霉菌共55株，曲霉屬（Aspergillussp.）、根霉菌（Rhizopussp.）、橫梗霉屬（Lichtheimiasp.）、根毛霉屬（Rhizomucorsp.）、紅曲霉屬（Monascussp.）、散囊菌屬（Eurotiumsp.）、擬青霉屬（Paeoilomycessp.）、毛霉屬（Mucorsp.）為重要功能性菌群，其中曲霉屬（Aspergillussp.）為醬香大曲霉菌的主體類群組成，占霉菌總數的一半以上。

1.3 醬香大曲中的酵母菌

酵母菌是中國白酒發酵過程中最重要的微生物，它們之間的相互作用會影響白酒的品質。酵母菌在高溫大曲中主要是酒化和酯化的作用，大曲中有很多類型的酵母，主要包含釀酒酵母、假絲酵母、產酯酵母等。不同類型的酵母菌發揮不同的作用，進而影響白酒的品質。羅方雯等[18]采用高通量測序技術對茅臺鎮醬香白酒主釀區域酵母菌群結構多樣性進行分析，結果表明，主釀區域醬香大曲的優勢酵母屬為復膜孢酵母菌（Saccharomycopsis）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces），其中Cystofilobasidium、Gibellulopsis、Yamadazyma、Eremothecium和Aessosporon為首次從醬香大曲中檢出，對研究醬香型白酒釀造中酵母菌群的變化規律及調控機制的研究有重要意義。WU Q等[19]從茅臺酒大曲發酵過程中獲得9種酵母菌，包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、粘質紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）等。結合生理和功能分析顯示酵母種群的多樣性非常高。這些酵母種類是重要的風味貢獻者，與各種醇、酸和酯的產生密切相關。了解酵母菌的特性和功能，有助于界定酵母菌在釀酒中的價值，從而使酵母在白酒生產中得到有效的應用。

綜上所述，醬香型白酒大曲中含有豐富的微生物群系，大曲中的優勢菌為醬香白酒提供了豐富的微生物資源，它們作為白酒釀造過程中生香和產酶的關鍵功能微生物，直接影響酒體風味的形成，調節重要香氣的形成，對釀造高品質醬香酒有重要意義。

2 醬香型白酒大曲微生物產香分析

2.1 白酒香味成分

白酒中的香味物質成分復雜、種類較多，如醇類、酯類、酸類、醛酮類化合物等，但絕對含量不大，研究白酒中的香氣成分對改善白酒釀酒技術有較大的意義。優質的醬香型白酒因具有“醬香突出，幽雅細致，酒體醇厚，回味悠長”的特點，而深得消費者的一致好評[20]。大曲中香味成分有不少出現在酒中，如四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、吡啶、糠醛等許多香味成分在大曲中都能檢測到[21]。

李登勇等[22]利用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對來源于不同生產地、企業和陳曲時間的6種醬香型大曲理化參數及揮發組分進行研究，共檢出113種揮發性化合物，其中50種物質在所有樣品中均檢出，其中三甲基吡嗪、苯乙醇、2,5-二甲基3-丁基吡嗪等11種揮發性物質含量較高。此外，還發現茅臺原產酒曲中吡嗪含量較高，而其他產區生產的醬香型酒大曲的揮發性成分主要為酯類。孫利林等[23]分析鑒定兩個醬香型酒廠大曲中的揮發性風味成分，共檢測到43種揮發性風味物質，其中酯類物質19種、醇類物質8種、烷烴類物質7種、吡嗪類物質5種、酮類物質4種。兩個酒廠共有的酯類是丁酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯，其中己酸乙酯相對含量均最高；兩個酒廠大曲共有的醇類是2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇、正丙醇，其中乙醇的相對含量均最高。WANG L等[24]分析了茅臺酒中含有的萜類化合物，將茅臺酒香氣的描述劃分為花香、果香、青草香、酸性、堅果香、甜味和其他香氣，共鑒定出55種化合物，其中30種為首次在茅臺中檢測到。

2.2 微生物產香

微生物對醬香型白酒獨特風味的形成起到了很大的作用[25]。醬香型大曲發酵中產生很多種揮發性成分，其中包括酯類和醇類、吡嗪、醛、酮、酸、酚、呋喃等[20]。這些成分主要是細菌、霉菌和酵母在大曲發酵過程中代謝產生的。張小龍等[26]從5個醬香型白酒廠取釀酒用大曲，利用氣相色譜-質譜（GC-MS）分析大曲的揮發性成分。結果表明，醬香型大曲中有很多揮發性成分，如醇、醛、酸、酯、吡嗪、酮、酚類等，其中棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸甲酯等6種高沸點酯是大曲中主要揮發性成分，這些成分由酵母代謝提供，酵母為白酒提供果香味成分，也提供重要風味成分愈創木酚類化合物。芽孢桿菌可以產生大量的吡嗪類物質和酸味物質，芽孢桿菌在發酵過程中也提供果香味成分。王小平等[27]通過常溫培養法和高溫培養法對醬香大曲中的產醬香風味菌株進行篩選，得到3株產醬香風味濃郁的菌株，對這3株菌進行形態觀察及分子生物學鑒定，確定該3株菌均為地衣芽孢桿菌。黃曉寧等[28]研究發現，強化添加地衣芽孢桿菌也可以顯著提高大曲中四甲基吡嗪的含量，四甲基吡嗪是白酒釀造的特征氣味，還是白酒的健康因子，并具有抗氧化性能；同時芽孢桿菌會影響發酵過程中微生物間相互作用，從而使得多種揮發性物質含量有所改變。鄧劍清[29]選育出4株水解酶活力高和醬香濃郁的芽孢桿菌，將其作為強化功能菌用于強化高溫大曲的生產，發現醬香型白酒強化高溫大曲中的香氣成分吡嗪類物質、苯甲醛、苯乙醇等明顯升高，有利于醬香型白酒的品質提高。ZHANG R等[30]采用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對地衣芽孢桿菌產揮發性物質進行了鑒定，主要成分為C4化合物、吡嗪類化合物、揮發性酸類化合物、芳香類化合物和酚類化合物，還發現接種了芽孢桿菌發酵劑的樣品揮發性化合物比未接種地衣芽孢桿菌顯著增加，添加芽孢桿菌發酵劑的蒸餾酒感官評價效果也有所改善。這些結果表明，芽孢桿菌是影響茅臺酒香氣特征的主要微生物之一。

3 醬香型大曲微生物產酶特性研究

3.1 醬香型白酒大曲酶系

在大曲的發酵過程中，微生物的生理和生化代謝會產生許多酶，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、液化酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等，進而形成獨特的酶系，這些酶可以將原料中的大分子物質分解為小分子，供微生物生長和利用以及進行發酵和代謝[31]。纖維素酶可催化β-1,4-糖苷鍵水解，可將纖維素降解為纖維二糖和葡萄糖。而蛋白酶能水解大曲中的蛋白質，為微生物生長提供營養物質，另一方面形成的氨基酸與葡萄糖發生美拉德反應，為白酒香味提供前體物質。脂肪酶能水解長鏈脂肪酸甘油生成游離脂肪酸和甘油，生成的產物構成了白酒中香味物質的本身或者前體物質[32]。

3.2 細菌產酶

芽孢桿菌是茅臺酒的主要增香細菌，它具有很強的分泌降解酶的能力，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和糖化酶，并能水解蛋白質和淀粉等大分子物質，產生各種芳香物質[33]。芽孢桿菌還能產生耐熱酶，可以降解細胞壁和其他多糖，可能與風味物質和前體如吡嗪有關，這些酶和芳香前體的產生也有利于大曲及其衍生物的生成[34]。地衣芽孢桿菌可產生70多種代謝產物，可通過固態發酵產生芳香族化合物、C4化合物、吡嗪和有機酸等，它在蛋白酶、脂肪酶、耐熱α-淀粉酶、纖維素酶等方面具有很強的酶促活性[35]。聶慧芳等[36]研究發現，在醬香型大曲中分離出的兩株枯草芽孢桿菌具有較高的蛋白分解能力。解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌是產生風味的菌株，它們能分泌α-淀粉酶快速發酵原料中的糖，完全分解成醇、酯和各種有機酸[37]。周曉龍[38]從醬香高溫大曲中篩選出一株具有高產四甲基吡嗪功能的芽孢桿菌，基于分子生物學技術和生理生化試驗，鑒定出這株菌株為解淀粉芽孢桿菌，通過進一步的產酶鑒定，該菌株同時能產蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、果膠酶等，其酶活性較高，且產酶種類豐富。放線菌可以產生淀粉酶、纖維素酶等酶類，有助于提高對原料的利用率和白酒的產量。在郎酒高溫大曲的制作中，高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）發揮重要作用，研究發現，優勢菌種包括普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）和甘蔗高溫放線菌（Thermoactinomyces sacchari），這兩種菌具有產淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等能力，還可以生成具有醬味的吡嗪類物質和土霉味的二甲萘烷醇等揮發性產物[39-40]。

3.3 真菌產酶

霉菌能產多種酶，且霉菌產各種酶酶活差異較大。WANG B等[41]通過宏蛋白質組學分析鑒定了白酒發酵過程中的51種碳水化合物水解酶。通過溯源分析發現白酒發酵過程中約80%的碳水化合物水解酶是由酒曲提供的，其中來自曲霉、根霉和毛霉的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶與淀粉水解和乙醇產量呈正相關。說明它們是白酒發酵過程中與酒精發酵相關的關鍵糖化酶。印麗等[42]分析茅臺白酒5個酒廠的釀造大曲，發現在醬香型白酒5種大曲中都能檢測到多種水解酶酶活，但各種酶活差異較大，可能與大曲中的霉菌種類有關。此外，分析從大曲中分離到的霉菌產酶活性，發現霉菌產糖化酶酶活和中性蛋白酶酶活差異較大。曲霉主要產糖化酶、蛋白酶、果膠酶等，毛霉主要產糖化酶和蛋白酶，根霉主要產糖化酶，青霉主要產脂肪酶和果膠酶，說明霉菌對大曲中酶系的形成有重要作用。

酵母菌在大曲酒發酵過程中發揮著兩個重要作用即酒化與酯化，酵母菌能產生酶來影響大曲的風味物質[43]。如扣囊復膜孢酵母能夠分泌淀粉酶、酸性蛋白酶及β-葡萄糖苷酶，其產生的水解酶可以分解大曲中的大分子物質，為釀酒酵母等其他參與釀酒的微生物提供營養[44]。

此外，在醬香型白酒釀造過程中，高溫大曲質量的差異會影響白酒的酒質和口感，篩選優質的高溫大曲的主要標志是蛋白水解酶的活性，一定條件下，蛋白酶的酶解反應和還原糖作用生成高含量、多種類的化合物，保證曲香濃郁、優雅純正[45]。

4 釀酒微生物在醬香型白酒生產中的應用

中國的經濟處于高質量發展階段，消費者對白酒品質的要求越來越高。研究表明，微生物的種類及數量對醬香型白酒的風味及質量有非常重要的貢獻。微生物對醬香型白酒生產中意義重大，其作用主要體現在以下幾方面：為制酒創造風味物質和菌源；為制酒提供各種酶類和呈香所需前體物質；為制酒提供原料。因此，可以說在醬香型白酒生產中微生物扮演著重要角色，是影響白酒品質的主要因素。劉宇等[46]在酒曲中添加3株細菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌）和2株霉菌（宛氏擬青霉、米曲霉）來強化醬香大曲，并將強化大曲應用于醬香酒的生產中。結果表明，添加適宜的功能微生物有助于提升醬香型白酒的質量。

強化大曲的醬香香氣較濃郁，醬香型白酒的醬香、空杯留香、細膩度和典型性等感官指標都得到了明顯改善，具有良好的應用前景。王西等[33]從高溫大曲中分離得到枯草芽孢桿菌，擴大培養后干燥成菌粉，模擬實驗應用于醬香酒的生產中。結果表明，發現接種枯草芽孢桿菌后四甲基吡嗪含量較高，同時發現在堆積之前加入枯草芽孢桿菌的作用效果明顯優于入池發酵前加入，表明接種芽孢桿菌有利于提升白酒口感與品質。盧君等[47]優選出釀酒酵母和粟酒裂殖酵母作為強化菌株，應用于生產的發酵實驗。結果顯示，在強化了耐酸酵母菌劑之后，而基酒產量有明顯的提高，提高比率在13.47%～25.97%之間，基酒質量除口感略偏甜外，其他風味指標沒有明顯差異。

5 前景與展望

隨著人們消費能力、消費水平的不斷提升，白酒市場仍然存在穩定增長的市場空間，醬香型白酒發展面臨重要機遇和良好條件。近年來，隨著科學技術的發展與大量先進分析檢測技術的應用，雖然取得了較好的研究進展，但是針對包括高糖化力菌株、高液化力菌株、高酯化力菌株、高產蛋白酶菌株以及特殊產香菌等在內的醬香型白酒大曲功能菌的挖掘與功能機制研究仍然是一項“永恒的課題”。目前，對于醬香大曲中微生物和白酒發酵酶系呈系統化深入認識比較少，后續有待于系統化揭秘白酒固態發酵機理。此外，保證白酒發酵過程中菌系、酶系及物系的相互作用，用于提高和突出白酒酒體質量和風味是廣大白酒科研工作者們共同努力的目標。除此之外，更值得一提的是，傳統發酵用微生物菌種，特別是白酒釀造微生物菌種的安全性已經成為傳統發酵食品安全關注的“核心問題”之一，基因安全性評價目前已納入微生物安全性評價的技術體系，但是國內外目前在白酒微生物基因安全性評價領域還存在著許多空白，相關技術體系與標準有待研究與建立。