藍莓果汁發酵工藝優化及揮發性風味物質分析

黃克霞，祝義偉，陳秋生，曾 濤*

（重慶食品工業研究所，重慶 400042）

藍莓（blueberry）被譽為“漿果之王”，果實含有豐富的氨基酸、維生素、花青素、黃酮、有機硒和有機酸等特殊營養成分[1]，不僅擁有比一般植物更強的抗氧化活性，還具有抗癌和抗炎等功能，在改善視力、延緩衰老、增強記憶力、降低糖尿病風險和促進心血管健康等方面有較強的保健功效[2-3]。藍莓深加工產品豐富，主要包括果汁飲料、餅干、罐頭、果醬等。因發酵果汁飲料營養豐富、酯香風味獨特，備受消費者喜愛[4]。發酵果汁在發酵過程不僅會產生大量的氨基酸、短鏈脂肪酸等營養物質和益生菌代謝產物，還能產生豐富的醇類、酯類等風味成分[5]。而發酵工藝作為發酵果汁加工的關鍵，其改進點主要集中在發酵方式和菌種的選擇方面[6]。發酵可以分為酒精發酵和非酒精發酵，酒精發酵主要采用酵母菌發酵，非酒精發酵主要為乳酸菌發酵[7]。

目前，發酵藍莓果汁飲料普遍采用乳酸菌發酵的方式，而酵母發酵多用于藍莓果酒及果醋的生產中[8-9]。吳萬林等[10]研究發現，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）與嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）單獨發酵和混合發酵藍莓汁在抗氧化能力和總酚的保留上無明顯差異，但混合發酵在花色苷和色澤的保留方面明顯優于單獨發酵。張玉慧[11]研究表明，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和植物乳桿菌復合發酵比例為1∶2時，具有協同發酵能力，所得發酵藍莓果汁香氣成分增加，揮發性香氣成分變化顯著。白琳等[12]研究發現，復合菌種（植物乳桿菌、乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus））發酵的藍莓酵素可提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。然而，采用酵母菌與乳酸菌混合發酵生產發酵藍莓果汁飲料的研究目前還比較少。

本研究以藍莓為研究對象，采用酵母菌與乳酸菌分階段發酵工藝制備發酵藍莓果汁，通過單因素試驗與正交試驗，考察酵母菌接種量、乳酸菌（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌）比例及接種量、發酵溫度與發酵時間對發酵藍莓果汁總酯含量以及感官評分的影響，并利用頂空固相微萃取（headspace-solidphase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用技術對發酵前后藍莓果汁揮發性風味物質進行分析。以期改善發酵藍莓果汁風味，并為其產業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓（夏普）：重慶市綦江區健力藍莓合作社；果膠酶（酶活10 000 U/g）：上海榮暉生物科技有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）菌粉（1×1010CFU/g）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）菌粉（1×1010CFU/g）：西安米先爾生物科技有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）粉BV818：安琪酵母股份有限公司；木糖醇、赤蘚糖醇、果葡糖漿、葡萄糖（均為食品級）：濟南康旭生物科技有限公司；低聚果糖（食品級）：量子高科集團有限公司；殼聚糖（食品級）：山東浩瀚食品添加劑有限公司；環己酮（純度99.90%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）手動進樣器、50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司；HP-5MS彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、6890N-5975B氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；WYT-J型手持糖度計：成都光學廠；WYA-2WAJ阿貝折射儀：上海力辰儀器科技有限公司；LRH-250生化培養箱：重慶市永生實驗儀器廠；JJ-2型組織搗碎機：常州朗越儀器制造有限公司；不銹鋼密封層疊板框過濾器：上海信步科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵藍莓果汁加工工藝流程及操作要點

原料預處理：挑選無機械碰傷和有病蟲害的藍莓1 kg，用自來水洗凈、晾干，加入等質量的純凈水，倒入榨汁機打成勻漿。

藍莓酶解：藍莓勻漿添加2‰果膠酶，50 ℃條件下酶解40 min[13]，100目尼龍網過濾。

調糖：測定藍莓汁的初始糖度，采用白砂糖將糖度調節至12°Bx。

酵母活化：添加0.5‰～3.0‰酵母菌粉BV818至50 mL 10%白砂糖水溶液中，37 ℃活化30 min。

酵母發酵：將酵母活化液添加到藍莓汁中，發酵溫度28 ℃，糖度下降至8°Bx以下結束發酵，85 ℃滅菌20 min。

乳酸菌發酵：將藍莓酵母發酵汁添加等體積的純凈水，混合均勻，糖度調節至12°Bx，85 ℃滅菌20 min，乳酸菌菌粉（植物乳桿菌：干酪乳桿菌比例3∶1）接種量為1.5‰。

調配：于乳酸菌發酵液中添加1%赤蘚糖醇、1%木糖醇和1‰低聚果糖，優化糖酸比，形成更加協調的口感。并按0.8‰添加殼聚糖[14]，于室溫靜置1 d，600目板框過濾器過濾。

滅菌、罐裝：將過濾后的發酵藍莓飲料罐裝至100 mL玻璃瓶中，采用巴氏滅菌方法滅菌后即得發酵藍莓果汁成品。

1.3.2 酵母接種量對發酵效果的影響

酵母以不同接種量（0.5‰、1.0‰、2.0‰、3.0‰）接種到藍莓汁中，于28 ℃發酵18 h，每隔6 h監測一次糖度，考察酵母接種量對第一階段發酵效果的影響。

1.3.3 乳酸菌發酵工藝優化單因素試驗

（1）植物乳桿菌∶干酪乳桿菌比例對藍莓果汁發酵效果的影響

酵母菌發酵結束后的藍莓發酵汁中添加等體積的純凈水，混合均勻，將糖度調節至12°Bx，乳酸菌菌粉的接種總量為1.5‰，乳酸菌（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌）接種比例為3∶1，30 ℃發酵18 h。在此基礎條件下，分別考察乳酸菌比例（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌=3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（g∶g），發酵溫度（22 ℃、26 ℃、30 ℃、34 ℃和38 ℃）、發酵時間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）對發酵藍莓果汁總酯含量及感官評價的影響。

1.3.4 乳酸菌發酵工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以總酯含量（Y）為評價指標，選擇乳酸菌（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌）比例（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）3個影響較大的因素為自變量，進行3因素3水平正交試驗，優化乳酸菌發酵工藝條件，因素與水平見表1。

表1 發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.5 分析檢測

可溶性固形物含量：手持糖度計測定；總酯含量的測定：回流皂化法[15]。

1.3.6 感官評價

由15名專業感官評價人員組成評定小組，依據發酵藍莓果汁的感官評價標準進行感官評價[16]，滿分100分。發酵藍莓果汁的感官評價標準見表2。

表2 發酵藍莓果汁的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented blueberry juice

1.3.7 揮發性成分檢測

HS-SPME條件：取混合均勻的5 mL藍莓發酵液于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有萃取纖維頭的手動進樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取48 min，熱解吸5 min后進樣進行GC-MS分析。

氣相色譜（gas chromatography，GC）條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：柱溫：40 ℃，起始溫度35 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升溫至190 ℃，再以8 ℃/min升溫至240 ℃，保持5 min；進樣口溫度：230 ℃；不分流進樣，載氣為高純氦氣（He），流速0.9 mL/min，溶劑延遲時間3 min[17-18]。

質譜（mass spectrometer，MS）條件：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；質量掃描范圍29～500 m/z。

定性方法：采用Wiley275譜庫和美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）17標準數據庫對揮發性成分進行比對分析，通過譜庫檢索和揮發性成分的質譜碎片信息、保留指數、保留時間等進行定性分析（匹配度＞80，最大值為100）；定量方法：以環己酮為內標（8.42 mg/L），采用內標法計算揮發性成分含量。

1.3.8 數據處理

采用Excel 2018進行繪圖，采用SPSS 24.0進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 酵母接種量對發酵藍莓果汁發酵效果的影響

酵母接種量對發酵過程中發酵藍莓果汁糖度的影響見圖1。

圖1 不同酵母接種量對發酵過程中發酵藍莓果汁糖度的影響Fig. 1 Effects of different yeast inoculum on sugar contents of fermented blueberry juice during fermentation

由圖1可知，隨著酵母接種量增加，在0～12 h內酵母發酵速度越快，降糖速度也越快。當酵母添加量≤2‰時，隨著酵母添加量增加，降糖效果更明顯；當酵母添加量＞2‰時，與2‰酵母添加量相比，對糖度變化無顯著影響。當發酵時間在12～18 h之間，糖度變化曲線趨于平緩，酵母添加量為1‰、2‰、3‰，對糖度變化無顯著影響。綜合考慮，選擇酵母接種量2‰為宜。

2.2 乳酸菌發酵工藝優化單因素試驗

2.2.1 乳酸菌比例對發酵藍莓果汁品質的影響

乳酸菌比例對發酵藍莓果汁感官評分和總酯含量的影響見圖2。

圖2 乳酸菌比例對發酵藍莓果汁感官評分和總酯含量的影響Fig. 2 Effects of lactic acid bacteria ratio on sensory scores and total ester contents of fermented blueberry juice

由圖2可知，隨著干酪乳桿菌占比增加，總酯含量呈先下降后平穩的趨勢，植物乳桿菌∶干酪乳桿菌比例為3∶1時，總酯含量最高（80.90 mg/L）；而感官評分呈先增加后下降的趨勢，當植物乳桿菌∶干酪乳桿菌比例為3∶1、2∶1時，產品的感官評分逐漸增加，當植物乳桿菌∶干酪乳桿菌比例為2∶1時，感官評分最高（94.5分）；隨著干酪乳桿菌占比繼續增加，感官評分降低至80.5分。植物乳桿菌在發酵藍莓果汁時可以進行蘋果酸-乳酸發酵，賦予藍莓果汁獨特的酯香風味，另外，植物乳桿菌具有多種氨基酸代謝酶，可以消耗藍莓果汁中的氨基酸，生成醇、醛、酸等代謝小分子物質，賦予產品更加豐富的口感[19]；干酪乳桿菌與其復配使用，可使有機酸、酯類等物質含量增多，風味更加飽滿[20]。綜合考慮，選擇乳酸菌（植物乳桿菌：干酪乳桿菌）比例2∶1為宜。

2.2.2 發酵溫度對發酵藍莓果汁品質的影響

發酵溫度對發酵藍莓果汁感官評分和總酯含量的影響見圖3。

圖3 發酵溫度對發酵藍莓果汁感官評分和總酯含量的影響Fig. 3 Effects of fermentation temperature on sensory scores and total ester contents of fermented blueberry juice

由圖3可知，隨著發酵溫度在22～38 ℃范圍內的上升，發酵藍莓果汁的總酯含量呈逐步上升后平穩的趨勢，發酵溫度≤34 ℃時，總酯含量逐步增加，發酵溫度＞34 ℃，總酯含量趨于平穩，當發酵溫度為38 ℃時，總酯含量最高（95.2 mg/L）；而感官評分呈先增加后下降的趨勢，當發酵溫度≤30 ℃時，產品的感官評分增加，當發酵溫度為30 ℃時，感官評分值最高（92.1分），當發酵溫度＞30 ℃，產品的感官評分下降。其原因可能是發酵溫度過低，乳酸菌生長遲緩，導致發酵能力差，不利于風味物質的形成；溫度過高，乳酸菌生長活躍，代謝旺盛，利于風味物質產生，但大量其他代謝物同時產生，比如有機酸增多，導致發酵藍莓果汁酸味過重，影響口感[21]。綜合考慮，選擇乳酸菌發酵溫度30 ℃為宜。

2.2.3 發酵時間對發酵藍莓果汁品質的影響

由圖4可知，隨著發酵時間在6～30 h范圍內的增加，發酵藍莓果汁的總酯含量逐漸增加，發酵時間≤18 h時，總酯含量增速較快，發酵時間＞18 h時，總酯含量變化趨于平穩，當發酵時間為30 h時，總酯含量達到最高值（93.20mg/L）；而感官評分呈先增加后下降的趨勢，當發酵時間≤18 h時，感官評分增加，當發酵時間為18 h時，產品的感官評分最高（96.7分），發酵時間＞18 h時，產品的感官評分下降。其原因可能是發酵時間過短，乳酸菌發酵不完全，酯化反應不夠充分，導致發酵藍莓果汁風味單調寡淡；發酵時間過長，乳酸菌生長旺盛，產生大量乳酸，抑制菌株自身生長，使得發酵藍莓果汁酸味過重，影響口感[22]。綜合考慮，選擇乳酸菌發酵時間18 h為宜。

圖4 發酵時間對發酵藍莓果汁感官評分和總酯含量的影響Fig. 4 Effects of fermentation time on sensory scores and total ester contents of fermented blueberry juice

2.3 乳酸菌發酵工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以乳酸菌接種比例（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）為影響因素，以總酯含量為評價指標，采用L9（33）正交設計，正交試驗結果及分析見表3。

表3 發酵工藝優化正交試驗結果及分析Table. 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

由表3可知，乳酸菌（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌）比例、發酵溫度以及發酵時間對發酵藍莓果汁品質有重要影響，通過正交試驗優化乳酸菌發酵工藝參數，可以獲得酯香風味更加濃郁的發酵藍莓果汁。由極差分析可知，影響發酵藍莓果汁總酯含量的因素，由高到低排序為：乳酸菌（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌）比例＞發酵時間＞發酵溫度。正交試驗最優組合為A1B3C2，即乳酸菌（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌）比例3∶1，發酵溫度34 ℃，發酵時間18 h。在此條件下進行驗證試驗，總酯含量為101.3 mg/L。

2.4 藍莓果汁發酵前后揮發性風味物質分析

藍莓果汁發酵前后揮發性風味物質檢測結果見表4。

表4 藍莓果汁發酵前后揮發性風味物質含量對比Table 4 Comparison of volatile compounds contents in fermented blueberry juice before and after fermentation

由表4可知，藍莓果汁在發酵前后揮發性香氣成分在種類和含量均發生了顯著變化，發酵前的藍莓果汁檢測出9種揮發性香氣成分，包括醇類（3種）、酚類（1種）、醛類（2種）、烯烴類（1種）、酯類（1種）以及其他類（1種）；發酵后的藍莓果汁共檢測出19種揮發性香氣成分，包括醇類（6種）、酚類（1種）、醛類（3種）、烯烴類（1種）、酯類（8種）。與發酵前相比，發酵后藍莓果汁的揮發性香氣中酯類物質增加7種，含量是其44.6倍；醇類物質增加3種，含量是其12.8倍；醛類物質增加1種，含量是其53%。酯類物質是芳香風味的代表，其中乙酸乙酯被賦予果香和酯香屬性[26]，己酸乙酯具有水果香味、曲香和菠蘿香型香氣[27]。醇類物質是酵母菌主要的代謝產物，風味多呈現清新的花草香味，其閾值一般很低，對風味的形成有不容忽視的作用[28]；醛類化合物多為果香及花香，閾值較低，賦予香氣能力較強，高含量的醛類物質可能會引起異味，乳酸菌發酵后代謝分解了大部分醛類物質，發酵后檢測到的苯甲醛具有櫻桃味和甜味，對風味起到加強作用[29]；因此，發酵后可賦予藍莓果汁更豐富的風味。金曉帆[23]研究結果表明，乳酸菌和酵母菌進行混合發酵可以顯著增加果汁中醇類和酯類的含量，產生令人愉悅的水果香和芳香味，這是由于藍莓果汁經過酵母菌發酵生成醇類物質，乳酸菌發酵生成酸類物質，并通過酯化反應生成種類豐富的酯類物質的原因[24-25]。

3 結論

本研究采用酵母菌和乳酸菌分階段發酵工藝制備發酵藍莓果汁，通過單因素及正交試驗優化藍莓果汁發酵工藝。最佳發酵條件為：酵母菌接種量2‰；乳酸菌（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌）比例為3∶1，接種量為1.5‰，發酵時間18 h，發酵溫度34 ℃。通過頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術對發酵前后藍莓果汁風味物質進行分析，發酵后的藍莓果汁共檢測出揮發性風味物質19種，相較于發酵前的藍莓果汁，酯類物質增加7種，含量是其44.6倍；醇類物質增加3種，含量是其12.8倍；醛類物質增加1種，含量是其53%。本研究對豐富發酵藍莓果汁香氣成分，改善發酵藍莓果汁品質具有重要意義。