基于高通量測序技術分析漢中地區泡菜水細菌多樣性

陳 佩，劉 瑩，翟彩寧，黨 輝*

（1.陜西開放大學中瑞旅游與酒店管理學院，陜西 西安 710119；2.陜西開放大學信息與智能技術學院，陜西 西安 710119；3.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119）

泡菜作為我國傳統發酵食品之一，廣泛分布于我國的華中、華北和東北等地區，因其味道酸甜、色澤鮮亮且口感脆生而深受廣大人民的喜愛[1]。陜西泡菜又稱為“陜西浸菜”，其制作工藝也相對簡單，主要以當地的辣椒、豇豆和蘿卜等蔬菜為原料，并輔以食鹽、生姜、八角和花椒等香辛料混合發酵而成[2]。漢中地處秦嶺山地和大巴山地的過渡地帶，位于陜西省西南部，陜甘川三省交匯處。因其獨特的地理環境和文化背景賦予了發酵食品特殊的風味。一項針對陜西省安康市泡菜水中細菌多樣性的研究發現其包含獨特的微生物群落[3]。蔬菜發酵不僅能有效延長其貯藏期，賦予其獨特的口感和風味[4-5]，還能有效提升其產品價值[6]。相關報道顯示，發酵期間微生物的生長代謝直接影響著泡菜的品質[7]。泡菜開始發酵之前，通常會加入老鹵作為“引子”加速泡菜的發酵進程[8]，且長時間循環使用的老鹵能賦予泡菜特殊的風味品質[9]。近年來，科研人員系統的解析了不同地區泡菜中微生物的多樣性[10]，結果顯示，乳酸菌為泡菜發酵過程中的優勢菌，對于泡菜的滋味具有重要的貢獻[11]。值得注意的是，泡菜水作為泡菜發酵的主要場所，含有大量的乳酸菌，直接或間接影響著泡菜的品質[12]，但目前關于泡菜的研究大多基于泡菜本身，而忽略了泡菜水在發酵過程中的重要作用。因此，針對泡菜水中微生物多樣性的研究是十分必要的。

近年來，隨著分子生物學技術的迅速發展和大數據分析的普及，以Illumina MiSeq為代表的第二代測速技術憑借其通量高、精度高和速度快等優點，廣泛應用于環境中微生物多樣性的解析[13-14]。相較于傳統微生物手段，高通量測序技術能不依賴于微生物的純培養，對環境中微生物的構成和多樣性進行全面的解析。目前，其已廣泛應用于泡菜[15]、白酒[16]和乳制品[17]等傳統發酵食品的微生物解析中。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序對漢中泡菜水中的細菌菌群結構進行解析，并采用生物信息學方法對其多樣性進行分析，同時結合多元統計學等手段探討了漢中泡菜水中微生物結構的差異，以期為后續泡菜工藝的改良和相關標準的制定提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

泡菜水樣本均采集自陜西省漢中市（33°04′03″N，107°01′24″E）下轄的農戶家中，共計30份，編號分別為P1～P30。泡菜水的制作時間均在2020年九月中旬到十月中旬左右，所有農戶在制作泡菜時，均添加了“老鹵”作為引子進行發酵，且所有的泡菜原料均為豇豆和辣椒。

1.1.2 試劑

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；TransStartTMFastPfuBuffer、FastPfuFlyDNAPolymerase和脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術有限公司；引物338F/806R：武漢天一輝遠生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；R920機架式服務器：美國Dell公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統：美國ProteinSimple公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

使用無菌采樣勺從攪拌均勻的泡菜壇中取400 mL漢中泡菜水于無菌采樣瓶中，分別對樣品進行編號后，低溫運回實驗室于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 宏基因組DNA提取和Illumina MiSeq測序

參照基因組試劑盒中提供的方法對漢中泡菜水中的宏基因組DNA進行提取，并依照王玉榮等[18]的方法進行16S rRNA V3-V4區的PCR擴增。將檢驗合格的PCR擴增產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，使用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序。

1.3.3 生物信息學分析

依照雙端序列的重疊關系對下機序列進行拼接，并依照郭壯等[3]的質控條件對合并序列進行質控，從而獲得高質量序列用于后續分析。基于QIIME平臺對漢中泡菜水中細菌組成和多樣性進行分析，其具體流程參照HOU Q等[19]的方法對細菌多樣性進行研究。

1.3.4 多元統計學分析

使用聚類分析對泡菜水進行分組分析；基于非加權和加權Uni-Frac距離對菌群結構進行主坐標分析；使用Wilcoxon檢驗對不同聚類中泡菜水的α多樣性和菌群結構進行差異性分析；使用R軟件進行數據分析和可視化；使用Origin 9.0軟件進行數據可視化。

2 結果與分析

2.1 泡菜水樣品中細菌菌群結構的分析

使用Illumina MiSeq高通量測序技術對漢中泡菜水中細菌菌群的構成進行分析，共產生1 395 532條高質量序列，平均每份泡菜水可獲得46 518條序列。劃分和刪除單序列操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）后，共得到9 172個OTU用于后續分析。泡菜水樣品中的細菌菌群主要隸屬于24個門的553屬。將相對含量＞1%的細菌門（屬）定義為優勢細菌門（屬），基于門水平，30份泡菜水樣品中細菌菌群結構見圖1。

圖1 基于門水平漢中地區泡菜水樣品中細菌菌群的結構Fig. 1 Structure of bacterial community of Paocai brine samples in Hanzhong area based on phylum level

由圖1可知，漢中泡菜水中的優勢細菌門有2個，分別為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為89.12%和7.89%。值得注意的是，變形菌門僅在少量泡菜水樣品中相對含量較高，而在大部分泡菜水樣品中相對含量較低，甚至不存在。由此可見，泡菜水中的細菌主要隸屬于厚壁菌門和變形菌門，且其相對含量存在較大差異。郭壯等[3]對陜西省安康市泡菜水中微生物多樣性的解析發現，安康泡菜水中的優勢菌門分別為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門（Actinobacteria），其結果與本研究存在一定的差異。在此基礎上，本研究基于屬水平對泡菜水中的細菌菌群結構進行分析，結果見圖2。

圖2 基于屬水平漢中地區泡菜水樣品中細菌菌群的結構Fig. 2 Structure of bacterial community of Paocai brine samples in Hanzhong area based on genus level

由圖2可知，漢中地區泡菜水中優勢細菌屬有4個，分別為片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和明串珠菌屬（Leuconostoc），其平均相對含量分別為52.06%、31.40%、4.89%和1.83%。由圖2亦可知，漢中泡菜水中的細菌大多隸屬于乳酸菌，且乳酸菌的累計平均相對含量＞85%。安康市和漢中市兩地泡菜水中細菌菌群構成較為相似，但優勢菌屬的組成和相對含量存在一定的差異。相關報道發現，泡菜的制作工藝和制作環境等均會影響泡菜水中微生物的構成[20-21]。

目前，相關研究已證實了泡菜中的主要細菌構成為乳酸菌，其對于泡菜的發酵和品質具有重要的作用[8]。乳酸菌能利用碳水化合物產乳酸，其可以將泡菜體系中的糖類物質轉化為乳酸，并產生乙醇、乙酸和二氧化氮等揮發性物質。其不僅可以賦予泡菜制品獨特的口感和風味，還能抑制雜菌和有害菌的生長以確保食品品質的安全[22]。片球菌屬和乳桿菌屬作為漢中泡菜水中的主要優勢菌屬對于其品質亦具有重要的作用。相關研究表明，動物和植物來源的片球菌屬能利用碳水化合物產生不同的非揮發性和揮發性物質，且非揮發性風味物質與香氣具有顯著相關性，有助于提升發酵制品的感官特性[23]；而乳桿菌屬作為發酵制品中最常見的菌屬之一，能顯著改善發酵制品的口感和風味[24]。

2.2 泡菜水樣品中細菌群落結構的比較

通過對泡菜水樣品中細菌菌群組成分析發現，漢中泡菜水樣品中細菌菌群組成之間存在較大的差異。因此，本研究為探究漢中泡菜水中細菌的整體結構，基于屬水平對泡菜水樣品中細菌菌群結構進行主坐標分析，結果見圖3。

圖3 基于屬水平漢中地區泡菜水樣品的聚類分析結果Fig. 3 Results of cluster analysis of Paocai brine samples in Hanzhong area based on genus level

當K值為2時，聚類效果最好（CH指數為65.8），即全部泡菜水樣本可明顯劃分為2個聚類。由圖3可知，30份泡菜水樣品可以被劃分為兩個聚類，其中隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品有16份，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水樣品有14份。通過對不同聚類中優勢細菌屬進行統計發現，隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水中以乳桿菌屬和假單胞菌屬為主，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水中以片球菌屬和乳桿菌屬為主。為進一步對兩組泡菜水中細菌菌群的整體結構進行解析，本研究基于加權和非加權的Uni-Frac距離對兩組泡菜水樣品中的細菌群落結構進行分析，結果見圖4。

圖4 基于非加權（a）和加權（b）Uni-Frac距離的主坐標分析結果Fig. 4 Principal coordinate analysis results based on unweighted (a)and weighted (b) Uni-Frac distance

由圖4可知，基于非加權的主坐標分析中，隸屬于不同聚類的泡菜水樣品在空間分布上具有明顯的分離趨勢，其中隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品主要集中在空間的對角線上，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水樣品則主要集中在空間的右上角。經多元方差分析發現，隸屬于不同聚類的泡菜水樣品中的細菌群落結構差異極顯著（P＜0.01）。由圖4亦可知，基于加權的主坐標分析中，隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品廣泛分布在空間的各個部分，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水樣品具有較高的收斂性，且全部位于聚類Ⅰ的95%置信區間內，經多元方差分析發現兩組泡菜水樣品細菌群落結構差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，隸屬于不同聚類的泡菜水樣品可能均各自存在一些相對含量較低，但均為獨特的細菌類群。但總體來說，漢中泡菜水樣品的主要細菌類群是相同的，且隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品中主要細菌類群較為多元化，而聚類Ⅰ的泡菜水樣品中細菌類群較為單一。在對β多樣性進行分析的基礎上，本研究同時對漢中泡菜水樣品的4種α多樣性指數進行比較分析，結果見圖5。

圖5 不同聚類的泡菜水樣品的α多樣性指數比較結果Fig. 5 Comparison results of α diversity index of Paocai brine samples belonging to different clusters

由圖5可知，經Wilcoxon檢驗發現，隸屬于不同聚類泡菜水樣品中的細菌類群在Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和發現物種數上均不具有顯著性差異（P＞0.05）。由此可見，漢中地區泡菜水樣品中細菌的多樣性和豐富度較為均一。在此基礎上，本研究對優勢細菌屬在兩聚類泡菜水樣品中的相對含量進行Wilcoxon檢驗，結果見圖6。

圖6 不同聚類的泡菜水樣品中優勢細菌屬相對含量的比較Fig. 6 Comparison of relative content of dominant bacteria genus in Paocai brine samples belonging to different clusters

由圖6可知，漢中泡菜水中的4個優勢細菌屬，有2個優勢細菌屬在兩組之間存在顯著性差異（P＜0.05），其分別為片球菌屬和乳桿菌屬。由圖6亦可知，片球菌屬在聚類Ⅰ中的相對含量顯著低于聚類Ⅱ（P＜0.05），而乳桿菌屬在聚類Ⅰ中的相對含量顯著高于聚類Ⅱ（P＜0.05）。由此可見，盡管片球菌屬和乳桿菌屬作為漢中泡菜水中的主要菌屬，但其相對含量存在顯著差異，這可能也是導致漢中泡菜水隸屬于兩個聚類的重要原因之一。

近年來，關于發酵食品中微生物多樣性的研究發現，不同地區的同一發酵食品中微生物的構成存在一定的差異，且相距越遠，差距越大。對照采樣信息發現，隸屬于聚類Ⅰ的泡菜水樣品大多采集自漢中地區的三個農村中，而隸屬于聚類Ⅱ的泡菜水樣品幾乎全部來自于同一個村落中。這可能是導致漢中泡菜水中隸屬于兩個聚類的主要原因之一。而值得注意的是，聚類Ⅰ中的極個別樣品并不屬于那三個村落中，而這有可能是由泡菜的種類所導致的。相關研究顯示，蔬菜（蘿卜、辣椒和豇豆等）表面存在大量的乳酸菌[25]，且不同的蔬菜表面存在的乳酸菌種類亦存在一定的差異，而這亦可能影響泡菜水中乳酸菌的種類和含量。

3 結論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對陜西省漢中市泡菜水樣品中的細菌多樣性進行解析，結果表明，漢中地區泡菜水中的細菌主要隸屬于24個細菌門的553個細菌屬，其中優勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為89.12%和7.89%；優勢細菌屬為片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和明串珠菌屬（Leuconostoc），其平均相對含量分別為52.06%、31.40%、4.89%和1.83%。基于屬水平進行主坐標分析發現，所有漢中泡菜水樣品可以劃分為兩個聚類；經Wilcoxon檢驗發現，隸屬于不同聚類泡菜水樣品的α多樣性指數無顯著性差異（P＞0.05），但細菌菌群結構存在較大差異（P＜0.05），且片球菌屬和乳桿菌屬的相對含量存在顯著差異（P＜0.05）。同時，不同聚類的泡菜水樣品中均存在一些低豐度物種，且這些低豐度物種均為一些較為獨特的細菌類群。