基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)葛根生津止渴功效的生物機(jī)制研究

★ 翟興英 涂珺 李佳 姜麗 張啟云 徐國良 黃超東 李冰濤（江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心/江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

葛根為豆科植物野葛的干燥根，習(xí)稱野葛。2020年版《中國藥典》記載葛根具有解肌退熱、生津止渴的功效。胰島素抵抗使胰島素敏感性降低，其導(dǎo)致血糖升高、脂肪及蛋白質(zhì)分解作用增強(qiáng)，滲透壓升高，使患者出現(xiàn)“三多一少”的典型糖尿病臨床癥狀。基于分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)葛根多種化學(xué)成分與胰島素抵抗靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合作用［1］。葛根總黃酮能有效降低鏈脲佐菌素復(fù)制的糖尿病小鼠的血糖水平，恢復(fù)胰島素水平，改善實(shí)驗(yàn)小鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)［2］。葛根生津止渴功效與其改善胰島素抵抗作用相關(guān)，但是其生物機(jī)制還未知。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，能夠從整體上分析藥材的潛在作用機(jī)制，為中藥多成分多靶點(diǎn)作用生物機(jī)制研究提供新的研究思路和研究方法。本研究以葛根胰島素抵抗為研究對(duì)象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探索葛根“生津止渴”的生物機(jī)制，為葛根實(shí)驗(yàn)研究及產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 葛根化學(xué)成分及活性成分［3］基于化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫檢索葛根活性成分［4］。刪除來源于莖、葉的化學(xué)成分，保留來源于地下根的化學(xué)成分，依據(jù)Linpinski五規(guī)則對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行活性篩選［5］。

1.2 活性成分作用靶點(diǎn) Swiss Target Prediction是一款在線分析工具［6］，能夠依據(jù)化學(xué)成分預(yù)測其潛在作用靶點(diǎn)。本研究使用Swiss Target Prediction 預(yù)測活性成分作用靶點(diǎn)。

1.3 胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)及葛根作用靶點(diǎn)收集GenCLiP 3是一款在線文本挖掘工具［7］，能夠通過輸入疾病關(guān)鍵詞查找、分析疾病相關(guān)的人類基因。為了提高獲取靶點(diǎn)的可靠性，本研究將雜志影響因子選擇為3～50，發(fā)表年限為1990年—2020年。

將葛根活性成分作用靶點(diǎn)與胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交叉分析，考慮靶點(diǎn)在胰島素抵抗的三大組織（肝、骨骼肌、脂肪）分布，提高作用靶點(diǎn)的可靠性，以藥材及疾病共有靶點(diǎn)且在三大組織有蛋白表達(dá)的靶點(diǎn)為葛根改善胰島素抵抗作用靶點(diǎn)。

1.4 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 以活性成分及葛根改善胰島素抵抗作用靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建活性成分及作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。用網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值評(píng)價(jià)活性成分重要性。

1.5 作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) STRING數(shù)據(jù)庫旨在提供多物種蛋白質(zhì)交互作用的數(shù)據(jù)，本研究將葛根改善胰島素抵抗的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫［8］，構(gòu)建靶點(diǎn)的交互作用網(wǎng)絡(luò)，基于節(jié)點(diǎn)在交互作用網(wǎng)絡(luò)中度中心型評(píng)價(jià)靶點(diǎn)重要性。

1.6 生物功能富集 生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）是常用的通路富集數(shù)據(jù)庫［9］。本研究將葛根改善胰島素抵抗的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 葛根化學(xué)成分及活性成分 本研究基于化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索葛根化學(xué)成分119個(gè)， 94個(gè)成分符合Linpinski 5規(guī)則 ，可能是葛根的活性成分。

2.2 葛根改善胰島素抵抗的作用靶點(diǎn) 本研究預(yù)測葛根活性成分作用靶點(diǎn)188個(gè)，發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)706個(gè)，葛根活性成分及胰島素抵抗疾病共有靶點(diǎn)40個(gè)，其中24個(gè)共有靶點(diǎn)在胰島素抵抗主要組織肝臟、骨骼肌及脂肪有蛋白表達(dá)，可能是葛根改善胰島素抵抗的作用靶點(diǎn)。見表1。

表1 葛根改善胰島素抵抗作用靶點(diǎn)

2.3 葛根活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用cytoscape 3.3.0軟件，依據(jù)預(yù)測的成分及靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建葛根改善胰島素抵抗的活性成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共有67個(gè)節(jié)點(diǎn)，103條邊。67個(gè)節(jié)點(diǎn)中24個(gè)為靶點(diǎn)，其與43個(gè)節(jié)點(diǎn)為葛根活性成分。對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的中心性分析，發(fā)現(xiàn)葛根活性成分中M35（sayanedine），M40（genistein），M33（3'-methoxydaidzein），M39（glycitein），M42（formononetin）的度值排序靠前，具有較多的作用靶點(diǎn)。可能是葛根改善胰島素抵抗的主要活性成分。

圖1 葛根改善胰島素抵抗的活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 葛根改善胰島素抵抗作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 將葛根改善胰島素抵抗的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，并設(shè)置蛋白交互作用可信度為中等，構(gòu)建靶點(diǎn)交互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出至cytoscape 軟件構(gòu)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化及網(wǎng)絡(luò)分析。該網(wǎng)絡(luò)有23個(gè)節(jié)點(diǎn)（蛋白在此交互作用置信條件下與其他蛋白無交互作用），47條邊。節(jié)點(diǎn)中心性分析發(fā)現(xiàn)EGFR（12），ESR1（9），PTGS2（9）的中心性較大，可能是藥物作用的重要節(jié)點(diǎn)。見圖2。

圖2 葛根改善胰島素抵抗作用靶點(diǎn)的交互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 通路富集分析 本研究使用DAVID在線工具對(duì)葛根改善胰島素抵抗作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析。葛根改善胰島素抵抗靶點(diǎn)富集顯著性代謝通路10條，涉及鈣離子信號(hào)通路，膽汁酸分泌通路，缺氧誘導(dǎo)因子1通路等。見圖3。

圖3 葛根改善胰島素抵抗作用靶點(diǎn)通路富集

3 討論

葛根具有生津止渴的功效，主消渴，2型糖尿病屬消渴的范疇，臨床上，葛根常用于2型糖尿病的治療，胰島素抵抗是2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一。為了探索葛根生津止渴功效的科學(xué)內(nèi)涵，本研究基于胰島素抵抗應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建了葛根改善胰島素抵抗的成分靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò)，探索了葛根改善胰島素抵抗的作用靶點(diǎn)，并富集靶點(diǎn)的作用通路。

基于葛根活性成分-靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò)，研究初步發(fā)現(xiàn)葛根43個(gè)作用于胰島素抗疾病靶點(diǎn)的活性成分。其中M35（sayanedine），M40（genistein），M33（3'-methoxydaidzein ），M39（glycitein），M42（formononetin）可能是葛根改善胰島素抵抗的主要活性成分。染料木黃酮（Genistein）是葛根中異黃酮類成分，能夠調(diào)控大鼠胰島素分泌，影響肝臟和脂肪組織的脂代謝［10-12］。3'-甲氧基大豆苷元（3'-methoxydaidzein）是一種家甲氧基異黃酮類化合物，現(xiàn)代研究該類化合物具有改善胰島素抵抗、改善調(diào)節(jié)脂代謝紊亂等作用；此外研究結(jié)果顯示3’-甲氧基大豆苷元具有較強(qiáng)的α葡糖糖苷酶抑制作用，能夠抑制葡萄糖的吸收［13-14］，此外，染料木素（glycitein）和芒柄花素（formononetin）均具有改善胰島素抵抗的作用［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)葛根改善胰島素抵抗的24個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，其中靶點(diǎn)EGFR、PTGS2、ESR1可能是重要靶點(diǎn)。EGFR是表皮生長因子受體，EGFR能夠通過PPARγ途徑,激活促進(jìn)NFκB激活，抑制炎癥的發(fā)生［16］，炎癥學(xué)說是糖尿病發(fā)病學(xué)說之一。環(huán)氧合酶是花生四烯酸代謝通路中關(guān)鍵限速酶，環(huán)氧合酶-2（PTGS2）催化花生四烯酸生產(chǎn)前列腺素等一系列炎性介質(zhì)。肥胖誘發(fā)的炎癥是胰島素抵抗發(fā)展的重要因素［17］。研究表明，葛根中阿魏酸、芹菜素、異甘草素等化學(xué)成分能夠抑制細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物PTGS2的表達(dá)［18-20］。2型糖尿病的患病率具有明顯的性別差異，絕經(jīng)前女性的發(fā)病率明顯較低。雌激素缺乏可能與代謝功能障礙之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，女性雌激素的減少可加速胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)生。雌激素是通過激活雌激素受體信號(hào)來抑制肝臟葡萄糖產(chǎn)生的［21］。葛根中活性成分大豆苷元、芒柄花素、染料木素等多種異黃酮類成分具有植物雌激素樣作用，能夠調(diào)節(jié)雌激素受體的表達(dá)［22-24］。

對(duì)葛根改善胰島素抵抗靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)鈣離子信號(hào)通路，膽汁酸分泌信號(hào)通路及缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路等是顯著性信號(hào)通路。鈣是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的第二信使，主要存貯在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，維持適量的鈣離子濃度有利于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸，反之，則內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸功能異常，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過JNK和IRS-1通路在激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和Akt/蛋白激酶B（PKB）途徑導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4型（GLUT4）囊泡到細(xì)胞表面，促進(jìn)胰島素抵抗［25］。膽汁酸由肝臟分泌，作為一種代謝調(diào)節(jié)因子,能夠激活多種核受體和膜受體介導(dǎo)的信號(hào)通路,參與多種代謝調(diào)節(jié)過程,不僅可以促進(jìn)食物中脂類的消化吸收,還參與糖、脂及能量的代謝,同時(shí)膽汁酸又是代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變與肥胖和2型糖尿病相關(guān)［26］。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是一種由缺氧激活的轉(zhuǎn)錄因子，在多種組織器官中表達(dá)，參與調(diào)控血管生成、細(xì)胞增殖和炎癥等，與多種代謝疾病均有關(guān)聯(lián)。脂肪組織和小腸缺氧，激活缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α和HIF2α，導(dǎo)致胰島素抵抗; 小腸中HIF2α的激活增加唾液酸酶3的表達(dá)，導(dǎo)致小腸和血清的神經(jīng)酰胺升高，促進(jìn)胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生; 此外，脂肪細(xì)胞中HIF1α可誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)來活化STAT3，增強(qiáng)炎癥因子表達(dá)、減少脂聯(lián)素表達(dá)，導(dǎo)致胰島素抵抗［27］。

葛根具有生津止渴的功效，臨床上可以改善胰島素抵抗，治療糖尿病，改善糖尿病三多一少的臨床癥狀。本研究基于胰島素抵抗應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探索葛根活性物質(zhì)、作用靶點(diǎn)及通路，初步研究發(fā)現(xiàn)葛根活性成分，可以作用于EGFR,ESR1，PTGS2等胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)，通過鈣離子信號(hào)、膽汁酸代謝、缺氧誘導(dǎo)因子等信號(hào)通路發(fā)揮生津止渴的功效，改善胰島素抵抗，治療糖尿病等疾病，為葛根功效深入研究提供了科學(xué)依據(jù)。