HMGB3對胎兒生長受限患者胎盤滋養層細胞增殖及凋亡的影響與機制分析

（西北婦女兒童醫院產二科，西安 710061）

胎兒生長受限（FGR），也稱為宮內生長受限（IUGR），是指胎兒大小異常，在宮內未達到其遺傳的生長潛能，在我國平均發病率達7%，嚴重增加圍產兒的發病率和病死率[1]。FGR的病因學非常復雜，目前還未能完全闡明。傳統上FGR的影響因素主要為孕婦因素、胎盤因素、臍帶因素、胎兒因素等，其中胎盤的位置或形態異常可能是導致FGR的重要的因素[1]。研究[2-4]表明，多種生物學過程參與FGR的發生過程，如滋養層細胞凋亡增加、氧化應激、螺旋動脈重建不足及血管生成異常。胎盤功能的完整是胎兒生長和發育的決定性條件，它是母體與胎兒之間營養與廢物交換的場所。胎盤中一些激素和生長因子的代謝和產生也可調節胎兒生長和母體生理[5]。如胰島素樣生長因子（IGF）-I和IGF-II具有潛在的致有絲分裂活性，其在不同的胎盤表面均有表達，并誘導體細胞生長和增殖[5]。另外還有許多其他重要的蛋白分子參與調控胎盤的生長和發育。這些蛋白的表達異常也可能會影響胎盤的功能，這在FGR的發生中占重要的作用。高遷移率蛋白（HMGB）具有特殊的DNA結合區域（HMG-box），可與DNA高度結合，影響DNA的雙螺旋結構，使DNA發生折疊，在轉錄、復制、重組、DNA修復、基因組穩定性等染色質的多種過程中發揮重要的作用[6]。一項從正常和FGR患者的胎盤組織中構建的大規模比較蛋白質組譜表明HMGB3在FGR胎盤中顯著下調[7]。除上述功能外，HMGB還能與其他轉錄因子或組蛋白相互作用。但是目前對于HMGB在FGR胎盤中的病理機制及其相互作用的蛋白的研究相對較少。本研究旨在探討HMGB在FGR胎盤中的功能及潛在作用機制，以期為FGR的治療提供新的理論基礎和靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月－2019年1月在西北婦女兒童醫院住院分娩的90例產婦，49例健康產婦為正常組，41例FGR患者為FGR組。診斷標準根據《婦產科學》[8]。2組年齡、孕周等一般資料比較無顯著差異，2組均無原發性高血壓、腎炎、糖尿病等其它疾病。在分娩后收集2組胎盤組織，從胎盤的母體側取3.0g組織，迅速置于液氮中速凍，之后保存于-80℃直至實時熒光定量PCR檢測。

1.2 細胞培養

人絨毛膜滋養層細胞系HTR-8/SVneo購自北京北納生物公司，將細胞培養在含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，傳代培養。取3～4代生長良好的細胞用于后續實驗。

1.3 細胞轉染

將細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于6孔板，孵育過夜。采用脂質體2000（上海碧云天公司）將2.5μg的HMGB3過表達質粒（HMGB3組）或空質粒（pcMV6-XL5，對照組）分別轉染入細胞中，轉染24h后，分別采用實時熒光定量PCR和WesternBlot法檢測轉染效率。過表達質粒及空質粒均購自美國OriGene科技公司。

1.4 細胞增殖檢測

采用上海碧云天公司的CCK-8細胞增殖試劑盒檢測各組細胞的增殖活性。將轉染24h后的細胞以每孔1×103個的密度接種于96孔板，孵育24h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，繼續孵育2h，用酶標儀在450nm處檢測吸光值（OD）。每組設4個復孔。

1.5 細胞凋亡檢測

收集轉染24h后的細胞，用AnnexinV-FITC/PI試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）染色，采用Kaluza流式細胞儀（美國貝克曼公司）檢測細胞凋亡率，用CellQuest軟件獲取和分析數據，激發波長為488nm。每組重復3次，取均值。

1.6 細胞遷移檢測

采用劃痕實驗檢測轉染24h后細胞的遷移能力。收集轉染24h后的細胞，以每孔4×105個的密度接種于6孔板，每孔加入2.5mL培養基，培養24h，用移液器在細胞表面劃1條直線，培養48h后，在倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度。細胞遷移率（%）= （劃痕即刻寬度-劃痕48h寬度）/劃痕即刻寬度×100%。

1.7 生物信息學方法

采用String生物信息數據庫分析與HMGB3相互作用的蛋白，并統計歸納這些蛋白參與的生物過程、分子功能、細胞組分。String數據庫的網址為https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=iGaB3N2IcuYy&input_page_show_search=on。

1.8 實時熒光定量PCR

采用Trizol試劑從轉染24h后的細胞中提取總RNA，取1μg總RNA，以RNA為模板，用M-MLV反轉錄酶合成第一次鏈cDNA，用BeyoFast?SYBR GreenqPCRMix試劑盒進行RT-qPCR擴增。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。GAPDH為內參，試劑盒均購自上海碧云天公司，引物均由上海生工公司設計并合成。

1.9 免疫共沉淀

采用RIPA試劑從轉染24h后的細胞中提取總蛋白，BCA試劑盒進行總蛋白定量。將20 μL瓊脂糖微珠A/G加入至100μg的總蛋白中，4℃預漂洗30min，之后用PBS洗3次。加入兔HMGB3多抗（1:500，賽默飛世爾中國），4℃孵育2h，加入40μL瓊脂糖微珠A/G，4℃孵育結合過夜，之后用PBS洗3次，加入20μL2×蛋白上樣緩沖液，混勻后95℃變性5min，之后進行WesternBlot檢測。

1.10 Western Blot

采用上述免疫共沉淀步驟提取總蛋白及蛋白定量分析。將20μg總蛋白加入上樣緩沖液中，用10% SDS-PAGE凝膠分離，之后將總蛋白轉至PVDF膜上，用5% BSA封閉45min，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫搖床孵育1h，TBST洗3次，每次5min。之后采用電化學發光試劑ECL于暗室發光，采用ImageJ軟件分析及處理條帶。GAPDH為內參。

1.11 統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統計分析，數據均采用均數±標準差（±s）表示，2組間對比采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1HMGB3的預測結合蛋白及其功能聚類分析

如圖1所示，根據String軟件預測，與HMGB3相互結合的蛋白共有10個，分別為NDNL2（抑蛋白樣蛋白2）、HMGN2（高遷移率族核小體結合域2）、NUMA1（核有絲分裂器蛋白1）、NUCKS1（核酪蛋白激酶和細胞周期蛋白依賴性激酶底物1）、GM2A（GM2神經節苷脂激活蛋白）、H2AFZ（H2A組蛋白家族成員Z）、SUPT16H（SPT16同源蛋白，促進染色質重構亞基）、SSRP1（結構特異性識別蛋白1）、BTAF1（B-TFIIDTATA-box結合蛋白相關因子1）和NPL（N-乙酰神經氨酸丙酮酸裂解酶）。根據String軟件中的GO分析對這11個蛋白（包括HMGB3）的功能進行聚類分析，結果如表1所示。GO生物學過程分析：5個參與DNA代謝過程，4個參與DNA修復過程，3個參與DNA重組過程，3個參與DNA復制過程。GO分子功能分析中：3個為核小體結合蛋白，5個為染色質結合蛋白，2個為核小體DNA結合蛋白，4個為含蛋白質的復合物結合蛋白，6個為DNA結合蛋白。GO細胞成分分析中：8個參與染色體組成，4個參與染色體部分組成，8個參與胞內細胞器內腔組成，7個參與核內腔組成，9個參與細胞核組成，3個參與染色質組成。

圖1 String軟件預測分析HMGB3的結合蛋白

表1 HMGB3結合蛋白的功能聚類分析

2.2 2組胎盤組織中HMGB3 mRNA 相對表達量比較

見表2。

表2 2組胎盤組織中HMGB3 mRNA 相對表達量比較

2.3 2組細胞增殖、凋亡和遷移的比較

見表3。

表3 2組細胞增殖、凋亡和遷移的比較

2.4 2組HMGB3結合蛋白mRNA 的表達

見表4。

表4 2組HMGB3結合蛋白mRNA的表達

2.5 2組HMGB3與其結合蛋白的相互作用情況比較

見表5。

表5 2組HMGB3與其結合蛋白的相互作用情況比較

3 討論

在孕早期，由于胎盤絨毛發育不完善，導致胚胎與母體血液之間的物質交換尚未完全建立，因此胚胎發育及滋養層細胞侵入子宮基質的過程是在一個相對缺氧的環境下進行的，缺氧環境是有利于滋養層細胞的增殖[9]。研究表明，在FGR的胎盤中可觀察到許多組織病理學變化，包括絨毛形態變化、絨毛梗塞和母體血管變化[10]，表明胎盤功能障礙可能是FGR的重要原因之一。因此，本研究首先觀察了HMGB3在FGR胎盤中的表達。與正常胎盤相比，HMGB3mRNA相對表達量在FGR胎盤中表達下調。隨后的體外實驗也表明HMGB3過表達可以促進HTR-8/SVneo滋養層細胞的增殖和遷移，同時抑制滋養細胞的凋亡。此結果與先前關于HMGB3在腫瘤細胞中的功能的研究一致[11]。研究結果表明，胎盤中HMGB3蛋白的異常低表達導致的滋養細胞功能障礙，可能是促進FGR發展的原因之一。

為探討HMGB3對滋養層細胞功能影響的機制，本研究采用生物信息學數據庫String進行HMGB3相關結合蛋白的預測，結果顯示，與HMGB3相結合的蛋白有10個，分別為NDNL2、HMGN2、NUMA1、NUCKS1、GM2A、H2AFZ、SUPT16H、SSRP1、BTAF1和NPL。對這些蛋白進行GO3個本體的功能聚類分析后發現，這10和蛋白基本均在細胞核內表達，且大部分參與染色體的功能及組成，其中NDNL2、NUCKS1、SUPT16H和SSRP1這4個蛋白的功能與HMGB3一致，參與DNA的代謝、修復、重組和復制等過程。為驗證滋養層細胞中HMGB3與其預測蛋白的結合情況，本研究采用免疫共沉淀法，用HMGB3抗體捕獲，然后依次用IgG（Input）、HMGB3、NDNL2、HMGN2、NUMA1、NUCKS1、GM2A、BTAF1、SUPT16H、SSRP1、H2AFZ和NPL抗體進行共沉淀，以此驗證及反映HMGB3與其預測蛋白的結合情況。結果發現HMGB3過表達可顯著抑制其與NDNL2蛋白的結合，可顯著增加其與HMGN2、NUMA1、NUCKS1、BTAF1、SUPT16H、SSRP1、H2AFZ蛋白的結合，對其與GM2A和NPL蛋白的結合無顯著影響。實時定量PCR實驗也進一步證實，HMGB3過表達抑制NDNL2mRNA的表達，增 加HMGN2、NUMA1、NUCKS1、BTAF1、SUPT16H、SSRP1、H2AFZmRNA的 表 達，對GM2A和NPLmRNA的表達無影響。因此，依照HMGB3對這些蛋白的調節作用，將這10個蛋白分 為3類： 上 調，HMGN2，NUMA1，NUCKS1，BTAF1，SUPT16H，SSRP1，H2AFZ；下調，NDNL2；無影響，GM2A和NPL。

本研究進一步分析這些蛋白分子的相關功能。HMGN2和NUCKS1都屬于高遷移率蛋白（HMG）家族成員，參與組織器官發育、染色體活性調節、DNA修復等多方面功能，此外NUCKS1還能被第二信使激活[12-13]，雖然目前關于FGR中HMGB3與HMGN2和NUCKS1蛋白相互結合調控的研究甚少報道，但從本研究的結果來看，HMGB3下調導致的HMGN2和NUCKS1抑制可能在FGR的致病過程中發揮重要作用。NUMA1為核有絲分裂器蛋白，是一種負責紡錘體極裝配的蛋白質，對細胞分裂的完成起非常重要的作用[14]。FGR中HMGB3下調可能會導致NUMA1下調，進而導致有絲分裂紡錘體異常，染色體排列異常，這些異常將直接影響胚胎的正常發育。BTAF1作為轉錄因子，可以與TATA結合蛋白（TBP）相互作用形成B-TFIID復合體，在RNA聚合酶II轉錄過程中發揮重要的調控作用[15]。轉錄和翻譯過程是合成結構蛋白和功能蛋白重要的過程，在胚胎發育、器官生長等過程中占據重要的地位。FGR過程中HMGB3誘導的BTAF1表達抑制可能也是導致轉錄受阻，胚胎生長受限的原因之一。SUPT16H和SSRP1是一種組蛋白伴侶FACT復合物的2個亞基，能夠在以染色質為模板的相關轉錄、復制和損傷修復等過程中發揮重要作用，可幫助組蛋白重新組裝到DNA上，以維持染色質的穩定性[16]。因此FGR中HMGB3下調導致的SUPT16H和SSRP1表達降低可能會破壞胚胎染色質穩定性。H2AFZ是組蛋白H2A變異體，為高度保守的組蛋白變異體，可在不同的細胞周期建立特殊的核小體結構來替換核心組蛋白，參與保護常染色體，防止形成異染色質，對基因組的穩定性也具有保護作用[17]。FGR中HMGB3介導的H2AFZ表達下調也可能是導致胚胎發育受限的重要原因。此外，NDNL2是一種神經元特異性的生長抑制因子[18]，本研究FGR中HMGB3下調可能導致NDNL2表達增加，抑制胚胎神經元生長發育，誘導胚胎發育受限。GM2A和NPL雖然在String軟件中預測可與HMGB3結合，但是本研究采用實時定量PCR和免疫共沉淀法檢測出，在滋養層細胞中HMGB3過表達對GM2A和NPL的表達與無顯著影響。總之，大部分HMGB3的結合蛋白參與DNA、組蛋白、染色質等的生物活動過程，在FGR中這些蛋白的表達異常將是導致胎兒生長受限、胎兒發育障礙的重要的原因。當然具體的作用機制還有待進一步研究，但希望本研究能夠為以后研究胎兒生長受限方面提供新的思路。

綜上所述，HMGB3在FGR患者胎盤組織中低表達，且HMGB3過表達可促進滋養層細胞增殖及遷移，抑制凋亡。HMGB3介導的DNA、組蛋白、染色質等活動異常可能是導致FGR發病的機制之一。