基于大鼠胸膜炎模型對甘草附子湯的抗炎作用研究

曲 帥，闞 鴻，李金花，丁 茹，趙麗茹

（1.吉林省生物研究所藥用真菌研究室，長春 130012；2.吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；3.貴州醫科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴陽 550014）

甘草附子湯源于張仲景的《傷寒論》，由甘草、黑順片、白術、桂枝四味中藥材組成，具有祛風除濕、溫經散寒、溫陽補中的功效，在臨床上應用廣泛，主要用于治療風濕、類風濕性關節炎等病癥，具有抗炎鎮痛作用。文獻報道[1]表明，甘草附子湯能夠通過下調去卵巢磁性大鼠的破骨細胞CathK的表達，抑制成骨細胞ColI蛋白的降解，對骨質疏松癥有一定的治療作用。目前對甘草附子湯的藥理學研究主要集中在利用佐劑型關節炎大鼠模型及膠原誘導關節炎小鼠模型來研究其抗炎機制[2-3]，但是尚無對其急性炎癥作用機制的研究。炎癥模型中，角叉菜膠誘導的急性胸膜炎是經典的急性炎癥模型，因其對藥物敏感且重現性較好，因此廣泛應用于抗炎藥物的篩選和評價中[4-5]。本研究觀察甘草附子湯對急性胸膜炎模型大鼠的抗炎作用，通過檢測相關的炎癥介質，初步探討甘草附子湯對急性炎癥的作用機理，以期為臨床用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，購于遼寧長生生物技術有限公司，合格證號：SCXK（遼）2015-0001，實驗前適應環境飼養1周。

1.1.2藥物與試劑 實驗所用中藥材甘草、黑順片、白術、桂枝均購自長春福百草大藥房。甘草附子湯的制備以甘草:黑順片:白術:桂枝按照1:2:1:2的比例，分別采用10倍蒸餾水和8倍蒸餾水進行回流提取，合并2次提取液后，減壓濃縮成浸膏。灌胃給藥時，以不同體積蒸餾水分別制備成不同濃度藥液。角叉菜膠，上海源葉生物科技有限公司產品；丙二醛（MDA）測定試劑盒，總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒，一氧化氮（NO）含量測定試劑盒，大鼠白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒，南京建成生物工程研究所。醋酸地塞米松片，天津天藥藥業股份有限公司。

1.1.3儀器 酶標分析儀（DNM-9602），北京普朗新技術有限公司；凱特TG16B臺式高速離心機，鹽城市凱特實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1造模及給藥 將健康雄性SD大鼠隨機分為6組，分別為正常對照組、模型組、醋酸地塞米松陽性對照組、甘草附子湯高、中、低劑量組，每組10只。醋酸地塞米松陽性對照組（3mg·kg-1），甘草附子湯高、中、低劑量組（13.2、6.6、3.3g·kg-1生藥）分別灌胃相應濃度藥物，連續灌胃7d，每天1次，正常對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。第7天于末次給藥30min后，模型組及各給藥組動物分別用乙醚輕度麻醉，仰臥位固定，剪去右側肋上毛，用酒精消毒皮膚。在右上肢下第7、第8肋骨間皮膚用剪刀剪一小切口，暴露肋間肌肉，在肌肉切口處向右胸膜腔內注入1%角叉菜膠（2mL·kg-1），正常對照組注入等體積生理鹽水，注射部位在左胸腔第6、第7助骨間，靠近鎖骨中線處。扎針時扎破后阻力消失時，立即停止，需快速進行，以免損傷肺臟[6-7]。致炎4h后各組動物再灌胃給藥或生理鹽水1次。

1.2.2標本采集與檢測 致炎8h后處死動物，剪開腹部皮膚暴露膈肌，用2mL生理鹽水分3次從胸腔最上部沖洗，吸取胸腔兩側所有的胸腔積液，量取其體積并觀察胸液的顏色狀態。大鼠胸腔積液的體積由量取的體積減去沖洗的生理鹽水計算而得。2000r·min-1離心10min，取上清液分別測定MDA、NO、SOD含量。沉淀物以生理鹽水稀釋，混勻進行白細胞計數。將胸膜炎模型大鼠中所取得的血清分離后，按試劑盒說明測定MDA、NO、SOD、IL-1β及TNF-a含量。

1.3 統計學方法

采用SPSS20.0分析數據，各組數據以均數±標準差（±s）表示，各組間數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甘草附子湯對急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液與白細胞計數的影響

見表1。

表1 甘草附子湯對胸膜炎大鼠胸腔滲出液體積與白細胞計數的影響（±s，n= 10）

表1 甘草附子湯對胸膜炎大鼠胸腔滲出液體積與白細胞計數的影響（±s，n= 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1生藥） 滲出量/mL-1 WBC/（×109·L-1）正常對照組 0.15±0.04 1.59±0.63模型組 0.96±0.16## 11.23±2.76##地塞米松組 0.003 0.24±0.09△△ 2.53±0.60△△甘草附子湯組3.3 0.56±0.21△△ 6.23±2.19△△6.6 0.48±0.14△△ 5.56±3.33△△13.2 0.34±0.14△△ 4.39±2.08△△

2.2 甘草附子湯對急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液中MDA、NO、SOD 含量的影響

見表2。

表2 甘草附子湯對胸膜炎大鼠胸腔滲出液中MDA、NO、SOD的影響（±s，n= 10）

表2 甘草附子湯對胸膜炎大鼠胸腔滲出液中MDA、NO、SOD的影響（±s，n= 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1生藥） MDA /（nmol·mL-1） NO/（μmol·L-1） SOD/（U·mL-1）正常對照組 — 6.20±1.30 5.34±1.23 90.72±3.33模型組 — 15.68±2.45## 23.35±5.16## 45.80±3.79##地塞米松組 0.003 10.74±2.46△△ 7.83±3.76△△ 79.04±3.12△△甘草附子湯組3.3 13.63±2.69 18.18±4.56△ 55.80±1.94△△6.6 13.16±2.60△ 16.57±4.98△△ 68.34±3.43△△13.2 12.17±2.81△△ 12.61±4.37△△ 81.52±5.50△△

2.3 甘草附子湯對急性胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD 含量的影響

見表3。

表3 甘草附子湯對胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD含量的影響（±s，n= 10）

表3 甘草附子湯對胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD含量的影響（±s，n= 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1生藥） MDA /（nmol·mL-1） NO/（μmol·L-1） SOD/（U·mL-1）正常對照組 — 7.49±1.10 14.53±3.19 103.99±2.63模型組 — 13.47±3.24## 23.15±3.81## 71.63±4.95##地塞米松組 0.003 8.22±2.10△△ 16.46±2.78△△ 90.37±2.96△△甘草附子湯組3.3 11.58±3.32 19.18±2.58△△ 78.52±3.00△△6.6 10.82±3.35 18.16±2.85△△ 79.61±2.83△△13.2 9.83±2.78△ 17.34±2.28△△ 89.03±3.88△△

2.4 甘草附子湯對胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影響

見表4。

表4 甘草附子湯對胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影響（±s，n= 10） （pmol·L-1）

表4 甘草附子湯對胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影響（±s，n= 10） （pmol·L-1）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1生藥） TNF-α IL-1β正常對照組 — 168.43±25.37 85.18±16.38模型組 — 260.78±34.75## 153.83±31.17##地塞米松組 0.003 189.62±31.77△△ 102.37±27.18△△甘草附子湯組3.3 230.88±43.00 157.66±35.70 6.6 246.92±53.96 145.62±24.39 13.2 221.05±25.13△△ 126.09±23.86△

3 討論

研究[8]表明，炎癥的發生和發展與自由基的損傷密切相關，氧自由基可與不飽和脂肪酸生成過氧化脂質，過氧化脂質可進一步分解為MDA等，因此MDA的含量可評價機體被脂質過氧化的程度。實驗結果表明，甘草附子湯高劑量組可抑制大鼠胸膜炎模型胸腔組織液和血液中的MDA，甘草附子湯低劑量組對其抑制作用無統計學意義，提示甘草附子湯的抗炎作用可能與抗氧化作用有關系，并且與劑量相關。SOD可在體內清除超氧陰離子，它的活性高低反映了機體清除氧自由基的能力，即機體的抗氧化能力。實驗結果表明高劑量的甘草附子湯可通過提高大鼠胸膜炎模型胸腔組織液和血液中的SOD活性，提高機體的抗氧化能力，進而起到抗炎的作用。

NO可在炎癥反應的許多環節中發揮復雜的調節作用，炎癥發生時，致炎物或炎癥介質可誘導或增加局部NO的合成和釋放，進而促進炎癥反應如血管擴張充血、水腫等。通過檢測NO的含量，我們發現，甘草附子湯中、高劑量組均可顯著降低大鼠胸膜炎模型胸腔組織液和血液中NO的含量，因此表明甘草附子湯可通過降低NO的水平對炎癥起到一定的抑制作用。

TNF-α主要由巨噬細胞產生，可誘導內皮細胞表達黏附分子，促進白細胞與血管內皮黏附、滲透，從而導致局部炎癥，是一種重要的促炎性因子和免疫調節因子，是調節炎癥的使動因素，可引起細胞死亡和組織損傷，參與人體多種急、慢性炎癥疾病的發生和發展[9-11]。IL-1也是參與炎癥反應最重要的細胞因子之一，可以通過誘導巨噬細胞COX-2基因的表達，使前列腺素的分泌增加而參與介導急性炎癥反應；增加合成趨化因子，促進大鼠體內多形核白細胞向局部炎癥部位聚集[12]；還能誘導出與TNF-α相似的生理和代謝改變，并與TNF-α產生相互協同作用，TNF-α還可以激發血管內皮因子釋放，刺激血管內皮細胞的合成，并表達IL-1β，同時IL-1β可以作用于TNF-α，加重TNF-α對內皮細胞的損害作用，促進炎癥細胞在損傷區聚集[13-15]。IL-1還可以直接作用于下丘腦發熱中樞引起發熱，刺激肝細胞分泌急性期蛋白，從而表現出急性炎癥的特征[16]。IL-β在中性粒細胞趨化、激活過程中起重要作用，是調節炎癥的始動因素和炎癥反應的重要介質，主要存在于關節內，因此研究甘草附子湯對大鼠IL-β的調節作用，對闡明其治療風濕和類風濕性關節炎疾病機理有重要提示作用[11]。此外，研究[17]表明TNF-α、IL-1β在胸膜炎炎癥調節中可發揮重要作用。甘草附子湯高劑量組可降低胸膜炎模型大鼠血液中IL-1β和TNF-α的含量，尤其可顯著降低TNF-α的合成和分泌，提示甘草附子湯的抗急性炎癥機理可能與抑制這2種炎癥因子的作用達到抗炎的效果相關。

本實驗表明，甘草附子湯對急性炎癥胸膜炎具有較好的抑制作用，尤其是高劑量組效果顯著，其抗炎作用機理可能與甘草附子湯具有抗氧化成分，能夠提高SOD的活性，減少MDA的生成以及能夠抑制NO、TNF-α、IL-1β炎性介質的釋放有關。本研究可為開發拓展甘草附子湯的臨床應用奠定理論基礎，但是由于炎癥是一個比較復雜的病理過程，受到機體多因素的影響，因此需要進一步從藥效物質基礎、毒理學等多方面多角度進一步揭示其作用機制。