人過渡性B細胞的基礎研究及相關靶向治療影響

黃夢貞，王詩軒，李菲

(南昌大學第一附屬醫院 血液科，南昌 330000)

B細胞的發育始于造血干細胞(hematopoietic stem cell， HSC)早期祖細胞，歷經數個階段發育成熟后形成不同的B細胞亞群[1]。B細胞發育過程中，新生B細胞具有明顯的自身反應性。因此，機體需要免疫耐受機制清除這類自身反應性B細胞(self-reactive B cell)。這主要通過2個耐受檢查點(tolerance checkpoint)進行篩選。第一個在骨髓中，為中樞耐受檢查點：前B細胞發育至未成熟B細胞后，其表面僅表達完整的mIgM，它與骨髓中的自身抗原結合非但不能激活B細胞，反而會引起細胞凋亡，導致克隆清除(clonal deletion)；同時還可能引起未成熟B細胞mIgM表達下調，這類細胞雖可進入血循環，但對抗原刺激不產生應答，形成失能(anergy)[2-3]。此外，一些完成基因重排并成功表達BCR(mIgM)的B細胞識別自身抗原后未被克隆清除，而是發生重組激活基因(recombinant activating gene，RAG)再活化，導致輕鏈VJ基因二次重排，合成新的輕鏈，替代自身反應性輕鏈，這一過程稱為受體編輯(receptor editing)。機體中(20～50)%的 B細胞發育經歷了受體編輯，這一過程在中樞耐受檢查點作用的發揮中起主要作用[3-5]。經歷選擇后的未成熟B細胞進入外周血并轉化為過渡性B細胞(transitional B cell，TrB)，進一步發育成熟(圖1[4，6])。通常人體從骨髓進入外周血的TrB當中約40%仍能夠對自身抗原產生反應，進一步的發育過程中，具有自身反應性的B細胞百分比減少至20%[4，7]。這提示在外周血中存在一個免疫耐受檢查點，它可繼續篩選出自身反應性B細胞并阻滯其發育成熟[1]，稱為外周耐受檢查點，其主要通過失能和克隆清除起作用。在生發中心，只有經歷陽性選擇完成親和力成熟的B細胞(表達高親和力IgM)才能繼續分化發育，阻礙親和力成熟和高親和力自反應性是外周耐受的主要機制。因此，只有一小部分對自身抗原無反應的TrB能通過選擇向初始B細胞(CD19+CD27-IgMloIgDhi)分化。近年來TrB作為骨髓與外周血間B細胞發育的橋梁逐漸受到重視，然而相關研究進展主要基于動物模型，關于人體的進一步研究較少。鑒于目前對人TrB發育、分化和調控機制認識的不足，文章結合近年來研究進展，介紹其在人類自身免疫性疾病發病機制中的作用及相關治療進展。

1 人TrB

1.1 細胞表型特征1995年Carsetti等[8]首次發現并標記了小鼠TrB，2003年人TrB被發現和描述[9]，但對后者的認知明顯滯后于小鼠。基于FACS的研究發現人TrB表型為CD19+CD27-CD10+CD24++CD38++[5]。與初始B細胞在某些方面類似，TrB也表達IgM和IgD，與此同時人TrB CD5分子表達增高。TrB在不同免疫器官中的百分比不盡相同，在外周血、骨髓和二級淋巴器官中其所占百分比分別為約10.0%、30.0%和(0.5～5.0)%[1，4]。

1.2 人TrB亞型的鑒定以CD21、IgD表達情況為標準可以將TrB分為T1和T2(CD10+CD24hiCD21loIgDlo和CD10+CD24hiCD21hiIgDhi)2種不同表型[10]。T2發育更成熟并表達更高水平的Bcl-2、CD23、CD44、IgD 和B細胞激活因子受體(B cell activating factor receptor, BAFF-R)，同時在體外凋亡受抑并更多向產生抗體的漿細胞分化[1，4]。另一研究發現了一種獨特的T3細胞，其表型特點為CD10-CD24intCD38intIgD+CD27-，因其高表達CD5而低表達CD10，故有一種觀點認為這種亞群更接近前初始B細胞(CD38loCD27-IgD+CD5+)[4，11]。B細胞由過渡向初始階段分化的時期，自身反應性B細胞在外周血經歷陰性選擇并顯著減少[1]。TrB的基因表達譜分析提示淋巴樣增強因子1[(lymphoid enhancer factor 1， LEF-1)，一種由未成熟淋巴細胞高表達的轉錄因子]在T1中高表達而在T2中低表達，而T2在體外具有較高的增殖和分泌Ig能力，因此T2比T1成熟[1]。

圖1 人B細胞的發育過程

2 TrB與疾病

2.1 TrB與免疫缺陷和移植研究發現X-連鎖淋巴細胞異常增生癥、STAT3缺陷和造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)后均有TrB數量的增加[4，12]。對HSCT后患者的隨訪研究發現一年內機體重建的B細胞中TrB占多數，且在早期95%以上的細胞是T1，隨著時間的推移，T2亞群逐漸增多，這表明T1先于T2被重建[4]。出乎意料的是，近年來的研究發現，TrB具備調節性B細胞[ (regulatory B cell， Breg)，CD19+CD24hiCD38hi]的免疫調控能力，早期TrB屬于Breg[13]。但在人體中，這些具備免疫調控功能的B細胞表型仍存在爭議。Blair等[14]研究發現，人TrB表達較高水平的IL-10和較低水平的TNF-α，這與上述觀點相符。Cherukuri等[15]對腎移植后患者外周血的研究發現，T1分泌IL-10、TNF-α的比值明顯高于T2或其他B細胞亞群，且T1/T2與腎移植預后有關，比值降低更有可能發生移植后排斥反應，提示TrB可作為腎移植預后判斷的指標之一。

2.2 TrB與自身免疫性疾病Cuss等[12]研究發現，SLE患者外周血中TrB百分比明顯增高，這在隨后的大規模臨床樣本研究中得到證實，部分研究認為TrB中的T1具有更高的自身反應性[1]。Liu等[16]發現我國SLE患者機體以Ⅰ型IFN依賴的方式促進了TrB的存活，這與NF-κB信號通路活化和促凋亡因子Bax表達降低有關，而IFN-γ對TrB的存活無明顯影響。在SLE患者中，TrB表面CD19表達下調，TLR9應答受損，并伴有Ⅰ型IFN、IL-6、IL-21、CXCL10等細胞因子和B細胞激活因子(B lymphocyte stimulator，BLyS/BAFF)的過度表達[17]。上述因素參與了B細胞耐受受損所致的早期過渡發育階段阻滯，導致機體自身反應性未成熟B細胞和自身抗體增多，其中干擾素刺激因子可能在促進TrB存活中發揮重要作用[17]；且TLR7信號通路激活可誘導IFN產生，促進自身反應性B細胞生成，參與疾病的發生[18]。原發性干燥綜合征(primary Sj?gren’s syndrome，pSS)患者外周血CD27-TrB和初始B細胞數量明顯增多，而BAFF-R表達顯著降低[19]。一項針對多發性硬化癥患者的研究發現，其外周血TrB數量明顯減少，而在腦脊液中發現了TrB，推測外周血TrB可能通過某種途徑穿過血腦屏障進入腦脊液并致病[20]。

3 B細胞靶向治療對TrB的影響

B細胞發育和功能調控異常導致了免疫耐受平衡的破壞，這是很多自身免疫性疾病的特征之一。因此，針對B細胞的靶向治療成為自身免疫性疾病治療策略的焦點，而相關的治療也影響了TrB。

3.1 貝利單抗(belimumab)BAFF是腫瘤壞死因子超家族的成員之一，參與B細胞活化、增殖與存活[5]。BAFF可抑制B細胞凋亡，促進其分化為產生Ig的細胞，BAFF的過度表達與SLE等自身免疫性疾病的發病密切相關[21]。貝利單抗是一類重組人IgG1λ單克隆抗體，2011年3月被FDA批準用于治療成人難治性SLE。它通過阻斷B細胞可溶性BLyS與BAFF-R結合，抑制自身反應性B細胞的分化和存活[21-22]。國外2項隨機、雙盲、安慰劑對照Ⅲ期臨床試驗表明，相較于安慰劑組，貝利單抗治療組有更多患者實現SELENA-SLEDAI評分下降，同時SLE反應者指數的反應率明顯升高，并且治療可減少激素用量、減輕疾病活動度及病情嚴重發作次數，且臨床耐受性良好[21]。同樣地，對于pSS患者，貝利單抗治療后初始B細胞和TrB的百分比及BAFF-R表達恢復正常，而漿細胞和已完成類別轉化的CD27+IgD-記憶B細胞數量無明顯變化，這表明貝利單抗影響的是新生成的B細胞但不降低自身反應性抗體水平[19]。然而，長遠來看，貝利單抗治療不影響患者血清BAFF水平，推測其可能通過調節BAFF和BAFF-R的相互作用以恢復外周血B細胞穩態[19]。基于SLE小鼠和患者的研究發現，貝利單抗主要在T1至T2期阻滯B細胞發育，治療后的患者體內T2、濾泡和邊緣區B細胞數量顯著減少，而T1數量明顯增加[23]。貝利單抗的療效已在2項Ⅲ期臨床試驗中得到證實且疾病活動度高的患者更有可能受益[21]。

3.2 利妥昔單抗(rituximab)CD20是B細胞特異性表面抗原，表達于B細胞在分化為漿細胞之前從前B到成熟B細胞的各個階段[5]。利妥昔單抗(商品名：美羅華)是一種針對B細胞表面CD20抗原的人鼠嵌合單克隆抗體，可通過ADCC、補體依賴的細胞毒性有效殺傷B細胞[24]。接受利妥昔單抗治療的SLE患者B細胞恢復規律與HSCT后淋巴細胞恢復規律相似，CD24++CD38++TrB數量迅速恢復且百分比增高[4-5]。長期的隨訪觀察發現利妥昔單抗治療后患者外周血TrB百分比明顯升高且自身抗體水平降低，同時，治療導致患者的CD20+記憶B細胞數量減少[4，25]。2014年，Wang等[26]研究也發現接受利妥昔單抗治療的SLE患者出現IgD+CD27-初始B 細胞數量明顯減少和CD27+漿母細胞數量明顯增加；雖然全部患者的病情均得到緩解，但只有50%的患者自身抗體水平有明顯下降。因此，利妥昔單抗能夠顯著減少B細胞總量，并能在B細胞重建過程中部分修復自身免疫檢查點缺陷。雖然早期的小規模研究得到了預期結果，但最近的2項大型隨機對照臨床試驗并未達到預期效果，這可能與利妥昔單抗介導B細胞耗竭后BAFF水平升高有關，其促使自身反應性B細胞的重建，削弱了療效[27]。因此，利妥昔單抗聯合貝利單抗(研究熱點)治療SLE可能產生協同作用，目前多個相關臨床試驗正在進行中[28]。

3.3 依帕珠單抗(epratuzumab)CD22特異性表達于B細胞表面，是BCR復合物的抑制性輔助受體。CD22的生物學功能尚未完全闡明，可能與BCR信號轉導的抑制、B 細胞的黏附與歸巢、B 細胞活化的調節密切關聯[29]。依帕珠單抗是一種特異性靶向CD22的人源化IgG1單克隆抗體，體外研究發現它還能通過增加CXCL12表達促進CD27-B細胞遷移，這提示其可通過影響B細胞的遷移阻滯其從骨髓釋放至外周血并抑制細胞成熟[30]。同時依帕珠單抗可抑制B細胞產生促炎細胞因子IL-6和TNF-α，而不影響IL-10的產生，具有免疫抑制功能[29，31]。依帕珠單抗輸注后可顯著減少CD27-TrB和初始 B細胞數量，而對CD27+記憶B細胞影響較小[30]。一項研究表明，接受依帕珠單抗治療的SLE患者其外周血循環B細胞數量可減少(35～40)%，疾病活動度也得到有效控制，但對血清Ig和自身抗體水平沒有明顯影響[32]。pSS患者接受依帕珠單抗治療后也能獲得相似的臨床療效。Jacobi等[33]研究發現CD27-IgD-記憶B細胞數量在SLE患者中異常升高并高表達CD95，與疾病活動度及復發率密切相關。Shock等[29]研究發現依帕珠單抗能夠明顯降低上述細胞百分比并下調CD95表達，同時在相當長的時間內維持雙陰性記憶B細胞數量穩定在低水平。因此，依帕珠單抗可能通過影響B細胞成熟以調控B細胞正常發育，抑制自身反應性B細胞進入外周血。最近一項評估了依帕珠單抗療效(1 921例SLE患者)的meta分析表明，依帕珠單抗可能是治療中重度活動期SLE的有效藥物[34]。

4 結語

TrB是B細胞發育成熟的關鍵階段，同時也是B細胞由骨髓向外周血釋放的中間節點，具有免疫不穩定性和免疫可調控性。TrB通過2個主要耐受檢查點阻滯自身反應性B細胞發生發育并誘導細胞凋亡，避免自身免疫反應的發生。此外，多種靶向B細胞的單克隆抗體可通過影響TrB的生成治療SLE、pSS、MS等自身免疫性疾病，但目前關于TrB仍存在許多爭議，需要進一步研究以揭示其內在本質。