固有淋巴細胞與動脈粥樣硬化

劉成興，林吉斌，李大主

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 心內科，武漢 430000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)是一種脂蛋白尤其是低密度脂蛋白(low density lipoprotein， LDL)在動脈管壁沉積引發的慢性炎癥性疾病，動脈壁沉積的脂質的氧化過程導致了包括巨噬細胞、T細胞和中性粒細胞在內的炎癥細胞的激活。伴隨著氧化型LDL(oxidized-LDL， ox-LDL)的沉積，組織駐留的免疫細胞、內皮細胞和平滑肌細胞產生了大量的促炎介質。其中，適應性免疫中的Th1被認為是產生促炎介質的主要來源，它分泌的促炎介質包括IFN-γ、IL-12和TNF-α，而AS斑塊內Th1型促炎反應相對Th2型反應占據絕對優勢，這導致了AS病變的進展。

除了適應性免疫細胞，巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞等固有免疫細胞也參與了AS的炎癥反應過程。作為一種新發現的固有免疫細胞， ILC參與了許多慢性炎癥的發展過程。新近研究發現，ILC可選擇性調控腸道淋巴組織定居的共生菌，進而實現對包括CD在內的慢性疾病和系統性炎癥的調控[1]。IL-23反應性的3型ILC(ILC3)調控了腸道免疫病理反應過程[2]。一項RA相關研究顯示，IL-9可依賴2型ILC(ILC2)激活Treg，實現炎癥的消除，在RA疾病緩解的患者血液中也檢測到高水平IL-9+ILC2[3]。近年來的研究發現，ILC在AS的發生、發展過程中也起著重要的作用，本文就此進行綜述。

1 ILC概述

ILC是近年來發現的一種新的淋巴細胞，其主要定位在外周組織尤其是黏膜屏障的表面。ILC表面不表達抗原特異性受體，也不存在基因組受體重排和克隆選擇過程，其應對組織功能受損的反應不依賴抗原刺激，不同ILC的分化依賴發育過程中特定的轉錄因子。雖然ILC有別于T、B細胞，但其功能上的多樣性與T細胞類似。ILC的3種主要類型是1型ILC(ILC1)、ILC2、ILC3，分別在功能上對應了Th1、Th2和Th17。ILC1可分泌IFN-γ。ILC2是可分泌Th2型細胞因子IL-5、IL-13的亞群，ILC2的分化和功能的發揮依賴轉錄因子GATA結合蛋白3(GATA-binding protein 3，GATA3)和維甲酸相關孤兒受體α(retinoid-related orphan receptor α，RORα)。ILC3包括所有可以產生IL-17和/或IL-22并且其分化和功能的發揮依賴轉錄因子維甲酸相關孤兒核受體γt(retinoid-related orphan receptor γt， RORγt)的ILC。NK細胞屬于ILC1，它可在IL-12、IL-18的刺激下分泌IFN-γ。此外，最近有學者在腸道內發現了一種新的ILC并命名為ILCreg[4]，在炎癥刺激時這種ILCreg可通過分泌IL-10抑制ILC1和ILC3的激活并減輕腸道炎癥反應，它還可以通過自分泌TGF-β1維持自身的分泌水平并促進自身擴增。

大部分ILC是組織定居細胞，它處于“待激活”的狀態并在激活后的數小時內分泌細胞因子以應對組織損傷，處于組織損傷防御的“第一線”[5-7]。例如，IL-12、IL-15和IL-18可激活NK細胞和ILC1，IL-2、IL-4、IL-25、IL-33、胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin， TSLP)可激活ILC2，IL-1β、IL-23可刺激ILC3增殖。

2 ILC與AS相關危險因素

目前已知的AS危險因素包括家族史、高血壓、高膽固醇、吸煙、肥胖和胰島素抵抗等，以上危險因素的早期干預對延緩AS的發展非常重要。許多研究發現，ILC參與了肥胖和胰島素抵抗等AS危險因素的發生、發展過程，了解這些過程對理解AS的病理生理機制十分重要。

2.1 ILC與肥胖和胰島素抵抗肥胖狀態下機體處在一種慢性的低水平炎癥狀態，這種炎癥可導致骨骼肌、脂肪組織和肝臟的一系列代謝改變，并最終導致系統性炎癥和胰島素抵抗等代謝綜合征。因此，肥胖和胰島素抵抗是密切相關的2種病理狀態，它們都是AS的主要危險因素。

研究人員在肥胖人群和小鼠的白色脂肪組織中觀察到ILC2水平下降而ILC1水平升高，這種升高的ILC1可在IL-12刺激下產生IFN-γ導致炎癥和胰島素抵抗[8]。此外，ILC2可以通過促進棕色脂肪細胞的增殖調節內臟代謝穩態[9-11]，從而實現促進脂肪組織能量消耗的目的[12]，這一作用可通過IL-13、嗜酸性粒細胞分泌的IL-4和M2型巨噬細胞(alternatively activated macrophage，AAM)分泌的兒茶酚胺3種途徑實現[10，13-15]。不僅如此，IL-33反應性的ILC2還可通過產生蛋氨酸-腦啡肽(MetEnk)直接刺激棕色脂肪UCP1的表達(UCP1是白色脂肪棕色化的分子標志之一)，誘導白色脂肪的棕色化[10]，從而增強其產熱性能，減少白色脂肪中存儲的脂質并增加能量消耗，實現對肥胖及其相關代謝綜合征的調控。

這些證據表明，ILC2在內臟脂肪組織代謝穩態的調控中發揮了至關重要的作用。因此，重建肥胖人群內臟脂肪的ILC2穩態可能是干預肥胖及其引起的胰島素抵抗的重要途徑。

2.2 ILC與高血壓高血壓的發生、發展伴隨著腎素血管緊張素系統(renin angiotensin system， RAS)異常、交感神經的過度活化和壓力鈉尿系統的異常。近年研究發現，炎癥性免疫系統激活是疾病進展和終末器官損害的重要機制。作為固有免疫系統的一部分，ILC也可通過其分泌的炎性介質參與高血壓的發展過程。

在血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ， AngⅡ)誘導的高血壓模型中，NK細胞可以遷移到主動脈壁并分泌促炎因子IFN-γ，敲除NK細胞后AngⅡ誘導的血管功能障礙則得到了緩解[16]。臨床上，肺動脈高壓患者也存在NK細胞的功能缺陷。有研究證實，NK細胞可以調節肺動脈和全身血管功能，而其對全身血壓的調節是依賴AngⅡ的[17]。因此，NK細胞可調控AngⅡ誘導的血管功能障礙和高血壓，其他亞群的ILC是否參與高血壓的發生、發展過程還有待進一步研究。

2.3 ILC與吸煙吸煙可導致血管內皮功能紊亂、氧化應激反應和血栓形成，它是導致AS的主要危險因素之一。吸煙也會導致ILC功能的變化。

吸煙會上調上皮來源的IL-33并減少其受體ST2在ILC2表面的表達，同時巨噬細胞和NK細胞上ST2表達增多，這種由吸煙導致的局部IL-33反應性變化使得機體在應對感染或慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)等炎癥刺激時Ⅰ型促炎反應過度激活，最終導致肺部疾病的加重[18]。這提示吸煙可改變ILC2通路的反應水平并在病理狀態下導致肺內炎癥反應的過度激活，但吸煙是否通過影響ILC調控AS仍然有待進一步研究。

3 ILC與AS

AS作為一種慢性炎癥性疾病[19]，炎癥反應貫穿了其發展的始終。ILC的不同亞群也參與了這一過程，它們通過分泌不同的細胞因子參與AS的炎癥免疫反應過程。

不同亞群ILC在AS疾病過程中發揮的作用不盡相同。總的來說，NK細胞和ILC1可以促進AS的發展，ILC2則可通過多種途徑減緩AS病損，由于ILC3可分泌多種細胞因子，不同細胞因子對AS的作用也存在差異，ILC3在AS中的作用還需要進一步研究。最新發現的ILCreg與Treg的作用較為相似，但仍需要更多的研究明確其是否參與了AS的發展過程。

3.1 ILC1與AS有證據表明，幾乎所有參與Th1型反應的分子均可促進AS的發生[20]，如T-bet[21]、IFN-γ[22]和IL-12[23]缺陷的小鼠都顯示出AS病損的改善。ILC1的發育過程也依賴轉錄因子T-bet，且也可分泌IFN-γ，因此ILC1在AS發展中的作用成為了研究者密切關注的話題。Wu等[24]在ApoE-/-Rag1-/-小鼠(去除了T、B細胞)體內敲低ILC1后觀察到AS病損的減輕，而且這種作用在過繼轉輸ApoE-/-TLR4+/+小鼠的ILC1后逆轉，而過繼轉輸ApoE-/-TLR4-/-小鼠的ILC1后不能改善，這表明ILC1依賴TLR4促進了AS的進展。也有研究者在ApoE-/-Rag2-/-IL-2RG-/-小鼠(缺乏T、B細胞和所有ILC)體內過繼轉輸NK細胞后加速了AS斑塊形成。以上研究表明，NK細胞和非細胞毒性ILC1均可促進AS的發生[25]，但其促進AS發生、發展的機制還有待進一步研究。

3.2 ILC2與AS研究發現，高脂誘導后STAT6敲除小鼠與WT小鼠相比AS斑塊面積顯著增加[26]。STAT6是影響Th2分化的關鍵轉錄因子，這項研究提示，Th2型反應參與了AS的發展。作為適應性免疫反應的“鏡像細胞”，越來越多的研究關注到ILC2在AS中的作用。在RORα(ILC2發育的關鍵調控因子)敲除小鼠中發現高脂誘導后其主動脈根部的脂紋面積相比對照組小鼠明顯增大[27]。也有學者關注到IL-33[28]、IL-25[29]和TSLP[30]這些可促進ILC2分泌細胞因子的抗AS作用。此外，有證據顯示IL-5和IL-13均可抑制AS的進展[31-32]。這些研究提示，ILC2抑制AS進展的可能性。從機制上看，將IL-5敲除小鼠的骨髓移植到Ldlr-/-小鼠體內，可以觀察到與對照組相比斑塊面積明顯增大，而這種作用與B1細胞產生的自身抗體IgM減少有關[31]。Perry等[33]在主動脈外膜周圍組織中發現了ILC2(原文為自然輔助細胞)的存在，并證實ILC2可分泌IL-5促進B1細胞產生AS保護性自身抗體IgM。這些研究提示，ILC2-IL-5-B1-IgM軸在AS中或許起到調控作用。由于Th2也可分泌IL-5，了解IL-5的來源有助于全面認識ILC2在AS中的作用。Perry等[33]的研究關注了這一問題，他們發現可促進B1a細胞增殖并產生自身抗體的IL-5并不來自Th2型反應或肥大細胞，因為這些細胞中只有不到2%是可產生IL-5的，而ILC2有50%是IL-5陽性的。因此，有理由推測ILC2抗AS的一個重要機制是通過IL-5產生的自身抗體發揮作用，抑制AS進展的IL-5也主要來自ILC2。但關于ILC2和Th的“對話”在AS啟動和發展中的作用還有待進一步研究。

ILC2分泌的另一個重要的細胞因子是IL-13。研究證實，IL-13可促進巨噬細胞“M2”轉變并抑制AS[32]。Newland等[34]首次在沒有Treg和Th2免疫影響的條件下研究了ILC2在AS中的作用，他們發現高脂飲食可改變ILC2的數量和其分泌的Ⅱ型細胞因子，將ILC2敲除小鼠的骨髓移植到Ldlr-/-小鼠體內后，與對照組相比，AS顯著加重；用IL-2/Jes6-1復合物擴增ApoE-/-Rag2-/-小鼠體內的ILC2后主動脈竇處的斑塊面積減小。進一步研究顯示，ILC2抑制AS的作用依賴其分泌的IL-13和IL-5，尤其是IL-13，機制與IL-13介導的巨噬細胞“M2”型極化有關。這提示，IL-13也參與了ILC2抗AS的作用過程。

Engelbertsen等[35]對CD25+ILC的研究表明，用IL-2/抗IL-2復合物擴增Rag1-/-Ldlr-/-小鼠CD25+ILC2可觀察到極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)水平的減低和AS的改善，而Newland等[34]擴增ILC2后觀察到了AS的改善但并沒有檢測到血脂水平的變化，原因可能是IL-2/抗IL-2復合物同時擴增了CD25+ILC1和CD25+ILC3。有趣的是，在Rag1-/-小鼠體內敲減ILC2后導致了小鼠脂肪組織沉積和體質量增加，嗜酸性粒細胞和內臟脂肪組織的AAM水平也明顯下降，而過繼轉輸ILC2到肥胖小鼠體內后逆轉了這一效應[9]。現有證據表明，ILC2可調節內臟脂肪代謝穩態并改善肥胖，但并沒有證據表明其通過調節脂質代謝影響AS的進展。AS和肥胖盡管是2種不同的病理狀態，但它們具有相同的病理生理學特征，脂質在AS和肥胖的發展中都起到了至關重要的作用，ox-LDL和游離脂肪酸分別啟動了2種疾病的炎癥反應過程。很顯然，炎癥反應是AS和肥胖的共同機制。脂肪組織釋放的脂肪因子可誘導胰島素抵抗，導致內皮功能紊亂和血液高凝狀態并引發系統性炎癥，這些因素都促進了AS的發生[36]。因此，ILC是否可以通過調控脂質代謝影響AS是一個值得關注的課題。

總而言之，活化的ILC2可以改善AS而在缺乏ILC2的情況下AS則顯著加重。ILC2改善AS的機制主要包括：(1)ILC2-IL-5-B1a-IgM自身抗體；(2)ILC2-IL-13-AAM。

3.3 ILC3與ASILC3可分泌IL-17、IL-22和GM-CSF，其中IL-17也可由γδT細胞、NKT分泌。目前關于IL-17及IL-22在AS中的作用結論并不一致[37]，而且ILC3主要分布在黏膜組織中，目前還未在AS斑塊中檢測到ILC3的存在，因此ILC3在AS中的作用還有待進一步研究。

3.4 ILCreg與ASILCreg顯然在功能上與Treg有相似之處。現有研究表明，Treg可通過細胞接觸和可溶性炎性介質(IL-10、TGF-β、腺苷、穿孔素/顆粒酶途徑)依賴的方式調控多種AS相關的適應性免疫效應細胞(如Th、B細胞)及固有免疫細胞(如NK細胞、巨噬細胞、DC)等的異質性分化和促炎/抑炎功能的轉化。目前，并沒有研究關注ILCreg在AS中的作用，但有理由推測，ILCreg或許可以通過其分泌的IL-10和TGF-β抑制AS的進展。

4 結語

ILC作為一類新發現的免疫細胞，研究發現在自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病等的發生、發展中起到重要作用。深入研究ILC在AS炎癥反應調節過程中的作用有望進一步闡明，完善AS的發病機制。另外，ILC的臨床價值有望進一步被發現，如其有可能成為臨床判斷AS斑塊不穩定的指標之一[38]；調控機體不同ILC亞群的百分比有望成為干預AS的手段之一。