約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟B細(xì)胞和NK細(xì)胞及其細(xì)胞因子的檢測(cè)

陳冰霞，張夢(mèng)欣，韓孟伊，張杰森，李勇森，金晨曦，齊艷偉

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 第三臨床學(xué)院，廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學(xué) 病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣州 511436)

據(jù)WHO報(bào)告，2017年全球約有2.19億瘧疾病例，大多發(fā)生于撒哈拉以南地區(qū)，病死率高，我國經(jīng)過積極的瘧疾消除工作，近幾十年來瘧疾得到了良好的控制[1]。但境外輸入性瘧疾成為主要來源，輸入性病例不斷上升[2]。NK細(xì)胞已被證實(shí)可抵抗病毒和細(xì)胞內(nèi)寄生微生物感染[3]，B細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答可保護(hù)機(jī)體[4-5]，二者均分泌多種細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-10和IL-2來抵抗感染[6-7]。

青蒿素類藥物是治療瘧疾的首選藥物，但其有一定的免疫抑制作用[8]，副作用明顯，如蕁麻疹等[9]，且有些蟲株出現(xiàn)了耐藥性。由于瘧原蟲逃避機(jī)體免疫作用的途徑較多[10]，也給疫苗研發(fā)帶來了挑戰(zhàn)。本研究探討約氏瘧原蟲感染中NK細(xì)胞、B細(xì)胞及其表達(dá)的細(xì)胞因子的作用，旨在為闡明約氏瘧原蟲的耐藥機(jī)制和瘧疾疫苗的研發(fā)提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 6～8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii)NSM株由廈門大學(xué)蘇新專博士和李劍博士惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 Hanks液、紅細(xì)胞裂解液、PBS購于生工生物工程(上海)股份有限公司；FCS、RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液購于ThermoFisher Scientific 公司；別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)-Cy7標(biāo)記的抗小鼠CD19、PB450標(biāo)記的抗小鼠CD3、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)-Cy7標(biāo)記的抗小鼠NK1.1、FITC標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ、PE標(biāo)記的抗小鼠IL-12、APC標(biāo)記的抗小鼠IL-10流式抗體購于Biolegend公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CytoFLEX FCM購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 感染模型的建立 取凍存的約氏瘧原蟲NSM株，注射到6～8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠腹腔進(jìn)行瘧原蟲復(fù)蘇。當(dāng)復(fù)蘇蟲株的小鼠原蟲率達(dá)8%左右時(shí)，精確統(tǒng)計(jì)原蟲率和小鼠此時(shí)的紅細(xì)胞密度。將10只6～8周齡雌性小鼠隨機(jī)分為感染組和正常組(5只/組)。經(jīng)尾靜脈向感染組小鼠注射106個(gè)瘧原蟲(稀釋到100 μL生理鹽水中)，正常組小鼠同時(shí)給予等量生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本采集 感染后第8天，頸椎脫臼處死2組小鼠，用75%的乙醇進(jìn)行浸泡，剪開小鼠腹部皮膚及腹膜，鈍性無菌分離小鼠脾臟。

1.2.3 脾細(xì)胞懸液制備 將分離的脾臟置于篩網(wǎng)中(200目)，加入1 mL Hanks液，用注射器內(nèi)芯研磨并收集脾臟研磨液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，離心(600×g，5 min，4 ℃)，棄上清液后加入10 mL Hanks液重懸細(xì)胞，離心，棄上清液，用Hanks液洗滌脾細(xì)胞2次。正常組小鼠脾細(xì)胞加入5 mL紅細(xì)胞裂解液，感染組小鼠脾細(xì)胞加入10 mL紅細(xì)胞裂解液，于室溫下放置5 min后分別向各管加入5 mL Hanks液終止紅細(xì)胞裂解，離心，棄上清液。加入5 mL Hanks液重懸脾細(xì)胞，離心(600×g，5 min，4 ℃)，棄上清液。用4 mL 含5%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸上述操作所得的細(xì)胞沉淀，置于200目篩網(wǎng)濾過至15 mL離心管，于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算并記錄細(xì)胞密度。

1.2.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞亞群 將細(xì)胞濃度調(diào)整為每孔100 μL中含有1.5×106個(gè)細(xì)胞，加入200 μL PBS洗滌1次，離心，棄上清液，每孔加100 μL PBS進(jìn)行重懸。按照說明書用量將適量流式抗體加入細(xì)胞懸液中，渦旋振蕩15 s以混合抗體和細(xì)胞；4 ℃避光孵育30 min后用2 mL PBS緩沖液終止染色，離心(600×g，5 min)，棄上清液后重復(fù)洗滌細(xì)胞1次；最后使用250 μL上機(jī)液重懸細(xì)胞。使用FCM對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，并用CytExpert軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 B細(xì)胞、NK細(xì)胞在約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟中的百分比分離感染組和正常組小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液。通過FCM檢測(cè)B細(xì)胞(CD3-CD19+)、NK細(xì)胞(CD19-CD3-NK1.1+)的百分比含量。結(jié)果顯示，感染組小鼠脾臟B細(xì)胞百分比[(60.36±3.43)%]高于正常組[(54.41±1.67)%，P<0.05]；感染組和正常組小鼠脾臟NK細(xì)胞百分比分別為(2.62±0.21)%、(3.90±2.02)%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(圖1)

注：A.各組小鼠脾臟B細(xì)胞百分比；B.各組小鼠脾臟NK細(xì)胞百分比。圖1 B細(xì)胞、NK細(xì)胞在感染組和正常組小鼠脾臟中的百分比

2.2 IFN-γ在約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟B細(xì)胞、NK細(xì)胞中的表達(dá)分離感染組和正常組小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液。通過細(xì)胞表面分子染色，檢測(cè)IFN-γ在B細(xì)胞和NK細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，感染組和正常組小鼠脾臟B細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的百分比分別為(0.16±0.03)%、(0.13±0.03)%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。感染組和正常組小鼠脾臟NK細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的百分比分別為(49.42±4.03)%、(53.31±9.43)%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(圖2)

2.3 IL-12在約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟B細(xì)胞、NK細(xì)胞中的表達(dá)分離感染組和正常組小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液。通過細(xì)胞表面分子染色，檢測(cè)IL-12在B細(xì)胞和NK細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，感染組小鼠B細(xì)胞表達(dá)IL-12的百分比[(0.70±0.10)%]較正常組[(0.43±0.02)%]明顯升高(P<0.01)。感染組和正常組小鼠NK細(xì)胞表達(dá)IL-12的百分比分別為(4.06±1.64)%、(4.35±1.31)%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(圖3)

圖2 IFN-γ在各組小鼠脾臟B細(xì)胞、NK細(xì)胞中表達(dá)的流式圖圖3 IL-12在各組小鼠脾臟B細(xì)胞、NK細(xì)胞中表達(dá)的流式圖

2.4 IL-10在約氏瘧原蟲感染小鼠脾臟B細(xì)胞、NK細(xì)胞中的表達(dá)分離感染組和正常組小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液。通過細(xì)胞表面分子染色，檢測(cè)IL-10在B細(xì)胞和NK細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，感染組和正常組小鼠B細(xì)胞表達(dá)IL-10的百分比分別為(1.19±0.36)%、(0.70±0.31)%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。感染組小鼠NK細(xì)胞表達(dá)IL-10的百分比[(6.88±0.97)%]較正常組[(4.89±0.43)%]明顯升高(P<0.05)。(圖4)

圖4 IL-10在各組小鼠脾臟B細(xì)胞、NK細(xì)胞中表達(dá)的流式圖

3 討論

脾臟是人體中最大的外周免疫器官，為固有免疫和特異性免疫發(fā)揮作用的共同場(chǎng)所。B細(xì)胞可通過分泌抗體和激活CD4+T細(xì)胞來發(fā)揮免疫效應(yīng)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分。而B細(xì)胞家族成員中的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞可分泌IL-35、IL-10等細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫抑制作用[11]。NK細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞的一種，可識(shí)別抗原成分，發(fā)揮自然殺傷作用。感染約氏瘧原蟲后，小鼠脾臟B細(xì)胞明顯增加，而NK細(xì)胞減少，這提示機(jī)體感染約氏瘧原蟲后，體液免疫已發(fā)揮作用，而NK細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫過程可能還未起作用。

IFN-γ是Ⅱ型IFN，可以激活巨噬細(xì)胞的功能和增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷作用[12]。同時(shí)其是促炎細(xì)胞因子的一種，能促進(jìn)炎癥反應(yīng)過程[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞分泌的IFN-γ在惡性瘧原蟲感染中發(fā)揮一定的作用[14-15]。在本研究中，小鼠感染約氏瘧原蟲后，脾臟B細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的水平下降，但與正常組沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示感染瘧原蟲后，機(jī)體在一定程度上并不是通過上調(diào)IFN-γ的表達(dá)水平來抵抗瘧原蟲感染的。

IL-12是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，主要由激活的免疫細(xì)胞產(chǎn)生，可驅(qū)動(dòng)Th1對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或原蟲的特異性免疫應(yīng)答[16]，調(diào)節(jié)Th1/Th2的比值，增強(qiáng)Th1的作用[17]。另外，IL-12的存在，可以增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)惡性瘧原蟲感染紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[18]。在本研究中，小鼠感染約氏瘧原蟲后，脾臟B細(xì)胞表達(dá)IL-12的水平升高，這提示機(jī)體可能通過上調(diào)B細(xì)胞表達(dá)IL-12的水平來發(fā)揮免疫作用。

IL-10為抗炎細(xì)胞因子的一種，可由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞等。同時(shí)人和鼠的NK細(xì)胞也可在各種外來病原微生物的刺激下產(chǎn)生IL-10[19-20]。其可以促進(jìn)Th0向Th2轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制Th1反應(yīng)[21]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10在感染約氏瘧原蟲小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能中不起主要作用[22]。在本研究中，小鼠感染約氏瘧原蟲后，脾臟NK細(xì)胞表達(dá)IL-10的水平明顯升高，而B細(xì)胞表達(dá)IL-10的水平?jīng)]有升高，這提示小鼠感染約氏瘧原蟲后，可能通過上調(diào)NK細(xì)胞表達(dá)IL-10的水平來發(fā)揮一定的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，C57BL/6小鼠感染約氏瘧原蟲后脾臟B細(xì)胞和NK細(xì)胞及其細(xì)胞因子均發(fā)生變化，但變化趨勢(shì)不同。目前，關(guān)于瘧原蟲感染后機(jī)體免疫功能變化的研究結(jié)論不一，有研究發(fā)現(xiàn)，在瘧原蟲感染中，機(jī)體巨噬細(xì)胞被激活，產(chǎn)生IL-12促進(jìn)NK細(xì)胞表達(dá)IFN-γ，IFN-γ又作用于巨噬細(xì)胞，激活T細(xì)胞發(fā)揮免疫保護(hù)作用[23]。此外，瘧原蟲感染機(jī)體免疫抑制的機(jī)制尚無定論，機(jī)體感染瘧原蟲后不僅可以抑制一些免疫細(xì)胞的功能，如DC和T細(xì)胞等[24]，而且可上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和IL-10表達(dá)，起一定抑制作用[25]。本研究結(jié)果提示，機(jī)體在抗約氏瘧原蟲感染中，NK細(xì)胞不但沒有發(fā)揮比較大的免疫保護(hù)作用，而且可能通過上調(diào)IL-10的表達(dá)水平來發(fā)揮一定的免疫抑制作用，而B細(xì)胞則通過上調(diào)IL-12的表達(dá)水平來激活NK細(xì)胞、T細(xì)胞功能發(fā)揮免疫保護(hù)作用。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步探討約氏瘧原蟲對(duì)青蒿琥酯的耐藥機(jī)制提供一定參考，且對(duì)瘧疾免疫疫苗的研發(fā)具有一定意義。