微陣列芯片法在抗呼吸道病原體IgM抗體檢測中的應用

朱子菲，黎村艷，曹友德，譚黎明，王啟廣，蘇娜，高建業，李洋，田鑫，楊偉國，張興旺，王平，葉華，馬華瑜，劉富菊，上官美榮，李瓊英，李夢，何禮凱

[1.湖南師范大學附屬第一醫院(湖南省人民醫院) 檢驗科，湖南省人民醫院轉化醫學研究所 醫學檢驗研究室，長沙 410005；2.蘭州大學第一醫院 檢驗科，蘭州 730000；3. 長沙衛實醫學檢驗所有限公司，長沙 410199；4.甘肅省人民醫院 檢驗科，蘭州 730000；5.深圳市賽爾生物技術有限公司，深圳 518055]

呼吸道病原體的檢測主要指檢測人體血清中引起呼吸道感染的主要病原體的IgM型抗體，因為呼吸道病原體感染人體1 w左右血清出現IgM滴度增高并急劇升至高位，持續1～2 w。因此，我國臨床上檢測血清樣本中特異性IgM以明確致病菌，方法主要有：間接免疫熒光法、ELISA法、堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯酶標法、直接免疫熒光法等，以明確呼吸道感染致病菌，幫助在診斷基礎上對癥和抗感染治療。其中間接免疫熒光法可同時檢測呼吸道多種病原體的IgM，特異性好，但是對操作人員要求高，不宜自動化、標準化；ELISA檢測抗病原體抗體的特異度和靈敏度高，操作簡便，成本較低，但是不能同時檢測2種及以上抗體。

微陣列芯片法(microarray)是近年來興起的一項技術，可用于食品分析、蛋白質組學、藥物篩選等方面。臨床上，微陣列芯片法可用于檢測幽門螺桿菌[1]、腫瘤標志物[2]和自身抗體[3]等。它可同時檢測的7種呼吸道感染病原體分別為：腺病毒(adenovirus， ADV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus， RSV)、流感病毒A型(influenza virus type A， IFV-A)、流感病毒B型(influenza virus type B， IFV-B)、副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)、肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae， MP)和肺炎衣原體(chlamydia pneumoniae， CP)。本研究旨在用微陣列芯片法和ELISA同時檢測2 269例臨床樣本呼吸道病原體IgM滴度，兩者檢測結果不一致時，用間接免疫熒光法確認，以評價微陣列芯片法在檢測呼吸道病原體IgM滴度中的應用價值。此外，用微陣列芯片法和對照方法檢測234例急性呼吸道感染者樣本，以評價微陣列芯片法對急性感染者的檢測能力。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2013年5月至2018年1月于湖南省人民醫院、甘肅省人民醫院和蘭州大學第一醫院門診或病房就醫的疑似呼吸道病毒感染者1 463例(病例組)及對照組806例(為同期確診的非呼吸道病原體感染者或健康體檢者)；另收集湖南省人民醫院7種呼吸道病原體急性感染者樣本各單項至少30例，共234例，具體信息如下(表1)。采集各組對象外周血，離心后收集血清，將完成臨床檢測的剩余樣本置-80 ℃保存備檢。病例組納入標準：臨床診斷為上呼吸道感染、急性喉氣管支氣管炎、支氣管炎、肺炎等疾病的呼吸道病原體感染者；臨床癥狀為發熱、咳嗽、咽痛、氣喘、哮喘、頭痛、聲音嘶啞、咳痰、鼻塞等的疑似呼吸道病原體感染者。對照組為確診非呼吸道病原體感染者或健康體檢者。急性感染組納入標準：具有危險因素及典型癥狀體征可診斷為急性呼吸道感染的患者。排除標準：嚴重心腦血管疾病患者；嚴重精神疾病或其他情況導致的不能配合者。本研究經3家醫院醫學倫理委員會批準(由于樣本為剩余樣本，故有知情同意豁免)。

表1 研究對象一般資料

1.2 試劑與儀器呼吸道病毒IgM抗體聯檢試劑盒(微陣列芯片法)，購自深圳市賽爾生物技術有限公司；7種呼吸道病原體感染IgM抗體檢測試劑盒(ELISA)，購自北京貝爾生物工程股份有限公司；9項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑盒(間接免疫熒光法)，購自Vircell公司；PCR檢測試劑盒，購自中山大學達安基因股份有限公司；IgG檢測試劑盒，購自北京貝爾生物工程股份有限公司；生物芯片閱讀儀SCIARRAY-Ⅰ，購自深圳市賽爾生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的制備 從-80 ℃冰箱取出樣本，平衡復融至室溫，搖勻備用。

1.3.2 微陣列芯片法檢測血清樣本IgM水平 操作按呼吸道病毒IgM抗體聯檢試劑盒說明書進行，用生物芯片閱讀儀檢測、判讀結果。

1.3.3 ELISA檢測血清樣本IgM水平 按各呼吸道病原體感染IgM抗體檢測試劑盒說明書進行。

1.3.4 間接免疫熒光法判定歧義結果 對于2檢測結果不一致的樣本，按9項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑盒(間接免疫熒光法)操作說明書進行，反應完成后判讀結果。

1.3.5 急性呼吸道病原體感染者血清IgG水平檢測 采用PCR檢測IFV-A、IFV-B，采用IgG檢測試劑盒檢測(動態檢測2次血清IgG)ADV、RSV、PIV、MP和CP。

1.4 統計學處理用SAS 9.4軟件進行統計學分析。2種試劑盒檢測結果的比較采用配對χ2檢驗，其一致性采用Kappa統計分析，κ>0.75表示2種檢測結果有高度一致性。研究中陽性符合率=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%;陰性符合率=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%;總符合率=(真陽性+真陰性)/(真陽性+假陽性+真陰性+假陰性)×100%。數據以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微陣列芯片法檢測結果微陣列芯片法檢測樣本IgM結果如下，陽性結果在相應位置顯藍色斑點，陰性則不顯色(圖1)。

注：A. 微陣列芯片表面7項檢測結果所處位點示意圖；B. 微陣列芯片法檢測IgM抗體陰陽性結果圖(共展示6份樣本)。圖1 微陣列芯片法檢測樣本IgM抗體滴度結果

2.2 微陣列芯片法與ELISA檢測結果比較結果顯示，2種方法的ADV、RSV、IFV-A、IFV-B、PIV、MP和CP IgM抗體檢測結果差異均無統計學意義(P>0.05)。2 269例樣本中，7種IgM的陽性符合率、陰性符合率、總符合率均大于90.0%，κ值均大于0.750 0。(表2)

表2 微陣列芯片法及ELISA檢測結果(n=2 269)

2.3 微陣列芯片法檢測急性感染期樣本結果微陣列芯片法與對照方法相比，ADV、RSV、IFV-A、IFV-B、PIV、MP和CP的陽性符合率分別為：91.2%、90.3%、86.8%、88.9%、93.5%、93.8%和93.8%，急性感染期樣本陽性符合率均大于臨床效能評價標準要求的急性感染期患者陽性樣本檢出率應≥80.0%(表3)。

表3 急性感染期樣本2種方法檢測的符合率

2.4 檢測結果不一致樣本分析對274例微陣列芯片法與ELISA檢測結果不一致的樣本，經間接免疫熒光法確認，微陣列芯片法中141例與之一致，133例不一致；ELISA中133例與間接免疫熒光法結果一致，141例不一致。

3 討論

呼吸道感染是一種常見病，其病原體種類多樣。研究結果顯示[4]，非典型病原體(除肺炎鏈球菌等常見細菌以外的病毒、衣原體、支原體等病原體)占呼吸道感染病原體中的很大比例，且容易出現混合感染，而因地區、季節、年齡變化引起的呼吸道疾病病原體也不同。導致呼吸道疾病的病原學比較復雜，傳統病毒檢測分離操作繁瑣，目前臨床醫生判定呼吸道病原體感染尚無金標準。因此，我國采用多種免疫標記技術檢測血清中特異性IgM滴度以明確致病菌，各種方法靈敏度、特異度不同，結果判定存在差異。

蛋白微陣列芯片是繼基因芯片后新興的蛋白質檢測載體，根據性能不同可分為蛋白質捕獲芯片(蛋白質檢測芯片)、蛋白質功能芯片和蛋白質反相芯片。蛋白微陣列芯片法是一種高通量、高靈敏度、特異度、高重復性且微量化的蛋白分析技術，根據檢測目的將各種蛋白(如抗原、抗體、酶、配體等)按設計的陣列有序固定于固相載體(如硅片、凝膠、玻璃片、尼龍膜等)，分析檢測樣本中能與探針蛋白特異性結合的靶蛋白。微陣列芯片不僅具有體積小、所需樣本和試劑量小、分析準確迅速、過程自動化、成本低等優點，還可進行一塊芯片多項指標聯合檢測并可整合檢測結果等優點，以便于對不同抗體檢測結果的比較[5]。李鑄衡等[6]研究發現，相比于傳統的ELISA，蛋白質微陣列芯片法具有較高的檢測靈敏度和極少的試劑消耗量。在相同反應條件下，抗原芯片對血清中抗體的識別靈敏度遠高于ELISA，相應的檢測靈敏度通常能提高1～2個數量級。另外，蛋白質芯片的檢測通量要遠高于ELISA，有助于獲得有關臨床表現形式和病理亞型的所有生物標志物數據集合，從而幫助進一步提高診斷及治療的準確性。

研究通過微陣列芯片法和ELISA分別檢測ADV、RSV、IFV-A、IFV-B、PIV、MP及CP的IgM抗體滴度，發現其陽性符合率分別為：94.7%、94.9%、95.3%、93.3%、93.3%、94.0%和93.6%；陰性符合率分別為：97.5%、97.7%、97.9%、97.9%、97.4%、98.0%和97.3%；兩者的一致性系數(κ值)分別為：0.919 8、0.923 6、0.931 2、0.916 3、0.908 6、0.924 7和0.909 3，各值均大于0.750 0，提示兩者的一致性較好。另外，本研究急性病毒感染檢測陽性符合率均大于要求的80.0%。

以玻璃為載體的微陣列芯片法作為興起的檢測技術，具有簡單、準確、特異度高等優點，且為硬基質芯片，容易自動化操作。它是檢出單一感染、混合感染中病原體的實用方法，為臨床早期診斷、治療提供了依據，還可配合其他檢測方法檢測呼吸道感染病原體，值得在臨床上推廣使用。