Pae下調(diào)miR-106a-5p/PTEN對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響

張彥芬，高大，易媛媛，趙榮偉

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，呼和浩特 010050)

白血病是兒童和青少年最常見(jiàn)的惡性血液系統(tǒng)疾病之一[1]。克隆性白血病細(xì)胞由于分化障礙，增殖失控，凋亡受阻等導(dǎo)致其在骨髓或其他造血組織中異常集聚，并浸潤(rùn)其他組織和器官，同時(shí)抑制造血組織的正常功能。目前對(duì)白血病的主要治療方法有放療、化療和異基因造血干細(xì)胞移植等[2]。盡管化療和異體移植的聯(lián)合應(yīng)用提高了療效，但化療藥物的副作用如導(dǎo)致心律不齊，加劇彌散性血管內(nèi)凝血以及產(chǎn)生耐藥性等降低了疾病的治愈率[2]。因此，尋找更加安全有效的治療藥物迫在眉睫。丹皮酚(paeonol，Pae)，又稱牡丹酚或芍藥醇，是牡丹根皮和徐長(zhǎng)卿的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)和心腦血管保護(hù)等多種藥理作用[3]。有體外實(shí)驗(yàn)表明，Pae可殺傷多種惡性腫瘤細(xì)胞[4]，有可能成為惡性腫瘤治療藥物。孫國(guó)平等[5]發(fā)現(xiàn)，Pae可抑制白血病細(xì)胞增殖，但其對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，而它殺傷白血病細(xì)胞的機(jī)制仍不清楚。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10，PTEN)作為抑癌基因，過(guò)表達(dá)可抑制白血病細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期[6-7]。miR-106a在多種白血病細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其在白血病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮一定作用[8]。研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究Pae對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響，進(jìn)一步觀察Pae對(duì)miR-106a-5p和PTEN表達(dá)的影響，探究其作用機(jī)制，以期為白血病的臨床治療提供新方法和新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器收集2016年1月至2017年1月于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科收治的初診白血病患者8例，經(jīng)血象和骨髓病理活檢臨床確診。白血病細(xì)胞K562，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；Pae試劑，購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液，購(gòu)自Hyclone公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol抽提試劑，購(gòu)自Invitrogen公司。抗miR-106a-5p、miR-NC抗體、miR-106a-5p mimics、miR-NC、siPTEN和siNC，購(gòu)自北京華大基因研究中心有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Promega公司。MTT試劑、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Annexin V-FITC/PI試劑盒、放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、Western blotting洗滌液及封閉液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。兔抗人PTEN、GAPDH、CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax多克隆抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-HRP，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。凝膠成像系統(tǒng)，來(lái)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；熒光定量PCR儀，來(lái)自ABI公司；FCM，來(lái)自BD公司；酶標(biāo)儀，來(lái)自AWARENESS TECHNOLOGY INC公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組參照文獻(xiàn)[9]方法分離初診白血病患者原代白血病細(xì)胞。使用RPMI 1640培養(yǎng)液分別培養(yǎng)該原代白血病細(xì)胞及K562細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)條件為濕度95%，溫度37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%。當(dāng)細(xì)胞鋪底率至約80%時(shí)，用胰蛋白酶消化后傳代。

藥物處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整密度，以2×105個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別給予不同濃度的Pae溶液[5](0、15、30、60 mg/mL)處理，依次標(biāo)記為Con組、Pae 15 mg/L組、30 mg/L組和60 mg/L組，培養(yǎng)24、48及72 h后，進(jìn)行下一步研究。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞K562，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，以2×105個(gè)/孔接種于96孔板。當(dāng)細(xì)胞鋪底率達(dá)60%時(shí)，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將抗miR-106a-5p和抗miR-NC抗體分別轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，依次命名為抗miR-106a-5p組和抗miR-NC組。將2組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，以待后續(xù)研究。按照上述轉(zhuǎn)染方法分別將miR-106a-5p mimics、miR-NC、siPTEN和siNC轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，用30 mg/mL Pae溶液處理，并依次分為Pae+miR-106a-5p組、Pae+miR-NC組、Pae+siPTEN組和Pae+siNC組，培養(yǎng)24、48及72 h后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)用TRIzol試劑分別抽提各組K562細(xì)胞總RNA，檢測(cè)其純度；反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物由北京華大基因研究中心有限公司合成，序列如下(表1)。miR-106a-5p和PTENmRNA的檢測(cè)分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，其相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

表1 引物序列

1.4 Western blotting檢測(cè)藥物處理或轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組K562細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解，提取總蛋白。通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒調(diào)整蛋白濃度。沸水浴3～5 min使蛋白充分變性，冷卻至室溫備用。取30 μg變性蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用洗滌液洗膜，后用封閉液室溫封閉1 h。除去封閉液，加入抗PTEN、GAPDH、CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax一抗(1∶1 000)，置側(cè)擺搖床4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌液洗膜后，加入相應(yīng)二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析目的條帶灰度值。

1.5 MTT法檢測(cè)取轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，接種于96孔板，按照1.2分組給予不同劑量藥物處理，培養(yǎng)24、48及72 h后于每孔加入MTT溶液(20 μL/孔)；孵育4 h后，吸凈孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，搖床均搖10 min至其完全溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度D(490 nm)。

1.6 FACS檢測(cè)取藥物處理或轉(zhuǎn)染48 h的各組K562細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心棄上清液后收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次。加入適量結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

丁珰這個(gè)人物是很值得深入挖掘的。她傾心于風(fēng)流倜儻的石中玉，憎厭這不解風(fēng)情的石破天。道德品質(zhì)，在他心中實(shí)在無(wú)關(guān)緊要。她喜歡刺激的人生，喜歡風(fēng)流的浪子。她將自己的愛(ài)情看得比什么都重要，卻把別人的愛(ài)情踩在腳底。她的愛(ài)是如此的狂烈，而又是如此的虛無(wú)，像極了她的小名，叮叮當(dāng)當(dāng)，熱鬧而又縹緲。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScanHuman 7.1網(wǎng)站(http：//www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)miR-106a-5p的靶基因。查詢發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p的5’端能與PTEN的3’UTR特異性結(jié)合，猜測(cè)PTEN是miR-106a-5p的靶基因。為驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，構(gòu)建野生型WT-PTEN和突變型MUT-PTEN的PTEN3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體。按1.2中LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-106a-5p和miR-NC分別與WT-PTEN和MUT-PTEN共轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱(濕度95%，溫度37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞PTEN的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 Pae對(duì)初診白血病患者原代白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響與Con組相比，Pae處理24 h后各組原代白血病細(xì)胞的增殖能力差異不顯著；與Con組相比，Pae處理48、72 h后各組白血病細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.05，圖1A)。與Con組相比，Pae 15 mg/L組、30 mg/L組及60 mg/L組原代白血病細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05，圖1B)。

注：A. Pae對(duì)初診白血病患者原代白血病細(xì)胞增殖能力的影響；B. Pae對(duì)初診白血病患者原代白血病細(xì)胞凋亡率的影響。與Con組比較，*P<0.05。圖1 Pae對(duì)初診白血病患者原代白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.2 Pae對(duì)白血病細(xì)胞K562增殖、凋亡的影響與Con組相比，Pae處理24 h后， K562細(xì)胞的增殖能力變化不顯著；Pae處理48和72 h后，各組K562細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.05，圖2A)。與Con組相比，15 mg/L組K562細(xì)胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(14.06±0.60)%]顯著升高，CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.68±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.76±0.00)]表達(dá)水平均顯著降低，p21[(0.21±0.00)vs(0.37±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.31±0.00)]表達(dá)水平均顯著升高；與Con組相比，30 mg/L組K562細(xì)胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%]顯著升高，CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)]表達(dá)水平均顯著降低，p21[(0.21±0.00)vs(0.57±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.47±0.00)]表達(dá)水平均顯著升高；與Con組相比，60 mg/L組K562細(xì)胞凋亡率[(6.51±0.13)%vs(28.66±0.18)%]顯著升高，CyclinD1[(0.79±0.00)vs(0.33±0.00)]和Bcl-2[(0.92±0.00)vs(0.36±0.00)]表達(dá)水平均顯著降低，p21[(0.21±0.00)vs(0.78±0.00)]和Bax[(0.16±0.00)vs(0.74±0.00)]表達(dá)水平均顯著升高。(均P<0.05， 圖2B～2E)

以上結(jié)果表明，Pae可抑制白血病細(xì)胞K562增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其抑制或促進(jìn)程度與Pae的濃度存在一定劑量效應(yīng)。

注：A. Pae對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響；B～C. Pae對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響；D～E. Pae對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與Con組比較，*P<0.05 。圖2 Pae對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 Pae對(duì)白血病細(xì)胞K562miR-106a-5p、PTEN表達(dá)的影響與Con組相比，Pae 15 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.99±0.00)]、30 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.50±0.00)]及60 mg/L組[(1.21±0.00)vs(0.41±0.00)]miR-106a-5p的表達(dá)水平顯著降低；與Con組相比，Pae 15 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.47±0.00)]、30 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.75±0.00)]及60 mg/L組[(0.31±0.00)vs(0.83±0.00)]PTEN的表達(dá)水平顯著升高。(均P<0.05， 圖3A、3B)

以上結(jié)果表明，Pae可抑制白血病細(xì)胞K562miR-106a-5p的表達(dá)，促進(jìn)PTEN的表達(dá)，其抑制或促進(jìn)程度與Pae的濃度存在一定劑量效應(yīng)。

以上結(jié)果表明，抑制miR-106a-5p表達(dá)可抑制白血病細(xì)胞K562的增殖，促進(jìn)其凋亡并影響相關(guān)蛋白表達(dá)。

注：A. Pae對(duì)K562細(xì)胞miR-106a-5p mRNA表達(dá)的影響；B. Pae對(duì)K562細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響。與Con組比較，*P<0.05。圖3 Pae對(duì)K562細(xì)胞 miR-106a-5p、PTEN表達(dá)的影響

注：A. miR-106a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量；B. 抑制miR-106a-5p表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞K562增殖的影響；C. 抑制miR-106a-5p表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響；D.抑制miR-106a-5p表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與抗miR-NC組比較，*P<0.05。圖4 抑制miR-106a-5p表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞K562增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)miR-106a-5p對(duì)Pae作用下白血病細(xì)胞K562增殖、凋亡的影響與Con組相比，Pae組K562細(xì)胞miR-106a-5p表達(dá)水平顯著降低[(1.21±0.00)vs(0.48±0.00)，P<0.05]；與Pae+miR-NC組相比， Pae+miR-106a-5p組K562細(xì)胞miR-106a-5p表達(dá)水平顯著升高[(0.46±0.00)vs(0.79±0.00)，P<0.05]。(圖5A)

Pae作用24 h后，Con組、Pae組、Pae+miR-NC組和Pae+miR-106a-5p組K562細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著變化(P>0.05)，48和72 h后，Pae組K562細(xì)胞增殖能力顯著低于Con組，Pae+miR-106a-5p組增殖能力顯著高于Pae+miR-NC組(均P<0.05，圖5B)。與Con組相比，Pae組K562細(xì)胞凋亡率顯著增加[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%]，CyclinD1和Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)、(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)]，p21和Bax的表達(dá)水平顯著升高[(0.21±0.00)vs(0.77±0.00)、(0.16±0.00)vs(0.67±0.00)](均P<0.05，圖5C、5D)。與Pae+miR-NC組相比，Pae+miR-106a-5p組K562細(xì)胞凋亡率顯著下降[(24.00±0.38)%vs(15.69±0.76)%]，CyclinD1和Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高[(0.37±0.00)vs(0.64±0.00)、(0.33±0.00)vs(0.62±0.00)]，p21和Bax的表達(dá)水平顯著降低[(0.78±0.00)vs(0.41±0.00)、(0.68±0.00)vs(0.40±0.00)](均P<0.05，圖5C、5D)。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-106a-5p可顯著逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)白血病細(xì)胞K562的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。

注：A. miR-106a-5p相對(duì)表達(dá)量；B. 過(guò)表達(dá)miR-106a-5p可逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用；C. 過(guò)表達(dá)miR-106a-5p可逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)K562細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；D. 過(guò)表達(dá)miR-106a-5p對(duì)Pae作用下K562細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與Con組比較，*P<0.05；與Pae+miR-NC組比較，#P<0.05。圖5 過(guò)表達(dá)miR-106a-5p可逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)白血病細(xì)胞K562增殖、凋亡的影響

2.6 miR-106a-5p靶向PTENmiR-106a-5p與PTEN3’UTR存在特異性結(jié)合位點(diǎn)(圖6A)。與miR-NC+WT-PTEN共轉(zhuǎn)染組比較，miR-106a-5p mimics+WT-PTEN共轉(zhuǎn)染組K562細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低[(1.10±0.00)vs(0.41±0.00)，P<0.05，圖6B]。與miR-NC+MUT-PTEN共轉(zhuǎn)染組比較，miR-106a-5p mimics+MUT-PTEN共轉(zhuǎn)染組K562細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.09±0.00)vs(1.09±0.00)，P>0.05, 圖6B]。與miR-NC組相比，miR-106a-5p組K562細(xì)胞PTEN表達(dá)水平顯著降低[(0.39±0.00)vs(0.07±0.00)]；與抗miR-NC組相比，抗miR-106a-5p組K562細(xì)胞PTEN表達(dá)水平顯著升高[(0.41±0.00)vs(0.82±0.00)]。(均P<0.05，圖6C)

以上結(jié)果表明，在K562細(xì)胞中，miR-106a-5p可負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)。

注：A. PTEN的3’UTR含miR-106a-5p的互補(bǔ)核苷酸序列；B. 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)；C. miR-106a-5p調(diào)控PTEN的表達(dá)。與miR-NC組比較，*P<0.05；與抗miR-NC組比較，#P<0.05。圖6 miR-106a-5p靶向調(diào)控PTEN的表達(dá)

2.7 抑制PTEN表達(dá)對(duì)Pae作用下白血病細(xì)胞K562增殖、凋亡的影響Pae作用24 h后，Con組、Pae組、Pae+siNC組和Pae+siPTEN組K562細(xì)胞增殖能力變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；48、72 h后，Pae組細(xì)胞增殖能力顯著低于Con組，Pae+siPTEN組細(xì)胞增殖能力顯著高于Pae+siNC組(均P<0.05，圖7A)。

與Con組比較，Pae組細(xì)胞凋亡率顯著升高[(6.51±0.13)%vs(24.26±0.92)%]，CyclinD1和Bcl-2表達(dá)水平顯著降低[(0.79±0.00)vs(0.46±0.00)、(0.92±0.00)vs(0.51±0.00)]，PTEN、p21和Bax表達(dá)水平顯著升高[(0.31±0.00)vs(0.74±0.00)、(0.21±0.00)vs(0.74±0.00)和(0.16±0.00)vs(0.67±0.00)]；與Pae+siNC組比較，Pae+siPTEN組K562細(xì)胞凋亡率顯著降低[(24.37±1.17)%vs(12.80±0.26)%]，CyclinD1和Bcl-2表達(dá)水平顯著升高[(0.47±0.00)vs(0.64±0.00)、(0.51±0.00)vs(0.69±0.00)]，PTEN、p21和Bax表達(dá)水平顯著降低[(0.82±0.00)vs(0.58±0.00)、(0.73±0.00)vs(0.49±0.00)、(0.68±0.00)vs(0.39±0.00)]。(均P<0.05，圖7B～7C)

可見(jiàn)，抑制PTEN表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)白血病細(xì)胞K562的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。

3 討論

近年來(lái)，隨著對(duì)中藥研究的不斷深入，Pae的抗腫瘤活性被不斷揭示。Pae在體內(nèi)外均具有抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[10]，其還可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡[11]。Pae與阿奇霉素的聯(lián)合應(yīng)用可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。Pae還可通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，抑制人胃癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲[13]。研究首先鑒定其對(duì)白血病患者原代白血病細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示Pae呈濃度依賴性地抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。隨后，以白血病細(xì)胞K562為研究對(duì)象的進(jìn)一步功能研究發(fā)現(xiàn)，Pae呈濃度依賴性地抑制K562細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與孫國(guó)平等[5]的研究結(jié)果相一致。同時(shí)，qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，Pae呈濃度依賴性地抑制CyclinD1和Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)p21和Bax表達(dá)，與其抗增殖、促凋亡作用吻合。此外，Pae呈濃度依賴性地抑制miR-106a-5p表達(dá)，促進(jìn)PTEN表達(dá)。研究結(jié)果提示，Pae對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡促進(jìn)作用可能與調(diào)控miR-106a-5p和PTEN表達(dá)有關(guān)。

注：A. 抑制PTEN表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用；B. 抑制PTEN表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)K562細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；C. 抑制PTEN表達(dá)對(duì)Pae作用下K562細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與Con組比較，*P<0.05；與Pae+siNC組比較，#P<0.05。圖7 抑制PTEN表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)白血病細(xì)胞K562增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

miR-106a-5p為miR-17家族成員。大量研究表明，miR-106a-5p在胃癌[14]、結(jié)腸癌[15]等多種腫瘤組織和細(xì)胞中異常低表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如，miR-106a-5p通過(guò)靶向PAK5抑制腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16]，還可靶向HMGA2抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[17]。張文娟[18]通過(guò)基因芯片技術(shù)證實(shí)，抗腫瘤藥物DMC可使慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中miR-106a-5p表達(dá)下調(diào)，證明miRNA在白血病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究顯示，抑制miR-106a-5p表達(dá)后，K562細(xì)胞的增殖能力顯著降低，凋亡率顯著增加，CyclinD1和Bcl-2的表達(dá)顯著降低，p21和Bax的表達(dá)顯著增加，與Pae對(duì)白血病細(xì)胞的作用一致。以上研究結(jié)果提示，Pae通過(guò)下調(diào)miR-106a-5p表達(dá)抑制白血病細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，而也有類似研究證明miR-106a-5p在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。

PTEN是最早發(fā)現(xiàn)的具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因。有研究表明，急性髓細(xì)胞白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病中PTEN表達(dá)均顯著下調(diào)[19-20]。慢性淋巴細(xì)胞白血病中PTEN的低表達(dá)可能與miR-26a和miR-214的異常表達(dá)有關(guān)[21]。miR-21還可通過(guò)調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路抑制白血病細(xì)胞K562的增殖和遷移[22]。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，PTEN是miR-106a-5p的靶基因，miR-106a-5p可負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)。由此提示，miR-106a-5p/PTEN信號(hào)通路在Pae針對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控中發(fā)揮一定作用。為進(jìn)一步證明Pae是通過(guò)下調(diào)miR-106a-5p/PTEN軸調(diào)控K562細(xì)胞增殖及凋亡的，將miR-106a-5p mimics或siPTEN轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，隨后用Pae處理，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-106a-5p或抑制PTEN表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Pae對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響。以上研究結(jié)果提示，Pae通過(guò)miR-106a-5p/PTEN軸參與調(diào)控白血病細(xì)胞的增殖和凋亡。然而，除miR-106a-5p/PTEN軸外，還可能存在其他調(diào)控途徑，這些問(wèn)題將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，Pae可通過(guò)下調(diào)miR-106a-5p/PTEN信號(hào)通路蛋白抑制白血病細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，這為白血病的臨床治療提供了新的方法和思路。