LPS下調肝細胞沉默信息調節因子2表達誘導急性肝損傷

賀明，張穎婷，魏倩，阮昕，安曉飛，孫英剛

(1.上海交通大學醫學院 病理生理學系，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海 200025；2.江蘇省中醫院 內分泌科，南京 210029；3.上海交通大學醫學院附屬新華醫院 心血管二科，上海200092)

炎癥是機體組織受損或遭受有害物質刺激后產生的一種適應性反應，與許多疾病的發生發展密切相關[1]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，是引起機體炎癥反應和休克的關鍵介質之一，可導致患者全身炎癥反應并發展成多器官功能衰竭[2]。肝臟作為機體最主要的代謝器官，是過度炎癥反應的主要受累臟器[3]。肝臟組織由多種細胞類型構成，包括：肝實質細胞、肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)、肝源性巨噬細胞(Kupffer cell， KC)、肝臟相關淋巴細胞(Pit細胞)和肝竇內皮細胞(sinusoidal endothelial cell， SEC)。肝臟中不同細胞間的相互作用在肝臟各種疾病的發生發展過程中發揮重要作用[4]。有研究發現，病理狀態下肝實質細胞可發生焦亡，釋放炎癥小體促進HSC的活化和肝纖維化[5]。還有研究表明，在脂肪性肝病肝細胞中沉積的脂質會引起肝實質細胞線粒體DNA釋放，KC中IL-33表達上調，加重組織炎癥損傷[6]。LPS引起肝細胞損傷的機制是其作用于KC，后者觸發炎癥反應并大量釋放TNF-α和IL-6等促炎因子，誘導肝細胞損傷和凋亡[7]。

沉默信息調節因子2(silent information regulator 2， SIRT2)是一種高度保守的NAD+依賴性蛋白去乙酰化酶，主要定位于細胞質[8]。在細胞處于有絲分裂不同階段或細胞受到不同刺激時，也可穿梭入核[9]。SIRT2 廣泛表達于腦、肝臟、肌肉和脂肪組織，其中在肝臟的表達量較高[10]。最近研究發現，在肥胖引起的炎癥反應過程中，肝臟SIRT2蛋白表達量先增加后減少，同時氧化態SIRT2即酶活性受抑制的SIRT2表達量明顯增加，最終抑制SIRT2發揮正常功能[11]。而在其他炎癥反應過程中，特別是LPS導致的炎癥反應中，SIRT2蛋白的表達變化機制及作用尚不清楚。

本研究通過動物模型和細胞實驗，探討LPS引起的肝臟炎癥損傷過程中肝細胞SIRT2的表達變化及作用。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物C57BL/6J小鼠，隨機分成2組(每組4～5只)，10～12周齡，雌性，體質量20～25 g，飼養于上海交通大學醫學院實驗動物科學部SPF級動物房。小鼠自由飲食飲水，以每籠3～5 只分籠飼養。飼養條件：室溫18～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度(40～60)%，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。所有實驗動物相關操作均經上海交通大學醫學院實驗動物使用和管理委員會批準。

1.2 實驗細胞系小鼠肝細胞系AML12、單核巨噬細胞系RAW264.7，購自美國菌種保藏中心。使用含10% FCS、40 ng/mL地塞米松、10 μg/mL胰島素、5.5 μg/mL轉鐵蛋白和5 ng/mL硒的 DMEM/F12 培養液培養AML12細胞系。使用含 10% FCS的DMEM培養液培養小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7。細胞均置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。

2 方法

2.1 LPS誘導小鼠急性肝損傷模型的構建將C57BL/6J小鼠隨機分成2組：生理鹽水(normal saline, NS)組(n=5)和LPS組(n=4)。LPS組小鼠給予腹腔注射LPS，劑量為20 mg/kg；NS組注射等量NS。2組給藥后24 h，于小鼠球后靜脈取血并分離肝臟，稱量肝臟質量，計算肝指數(liver index, LI)，LI=肝濕質量/體質量×100%。

2.2 肝損傷血清學指標的檢測離心收集肝素抗凝管中全血血清。通過ALT和AST試劑盒(96T)及LX-20 全自動生化分析儀檢測小鼠血清 ALT和AST水平。

2.3 肝臟組織病理學觀察用4%多聚甲醛固定小鼠肝臟組織，石蠟包埋，切片后進行HE及TUNEL染色。用F4/80(1∶125)和SIRT2(1∶250)抗體孵育樣本，行免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)染色，于顯微鏡下觀察。

不同染色觀察過程中，分別抓取 20 個視野，記錄TUNEL或F4/80染色陽性細胞數。

2.4 Western blotting檢測肝臟SIRT2蛋白的表達分離小鼠肝細胞和AML12細胞蛋白，進行10% SDS-PAGE；將蛋白質轉移至NC膜，用5%脫脂牛奶封閉后，加入抗SIRT2(1∶1 000)、cleaved Caspase-3(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育12 h；滴加抗IgG-HRP二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。通過ImageQuant LAS4000mini化學發光成像儀顯影。

表1 real time-PCR引物序列

2.6 肝細胞增殖能力的檢測于96孔板中接種5×104個/孔AML12細胞，貼壁后分別用不同條件處理24 h。分別滴加CCK8試劑(10 μL/孔)培養2 h，使用LX-20 全自動生化分析儀檢測肝細胞增殖情況。

3 結果

3.1 LPS誘導小鼠肝臟急性炎癥反應分別腹腔注射C57BL/6J小鼠NS或LPS。24 h后，相較于NS組， LPS組小鼠LI顯著增加(P<0.05，圖1B)，但肝質量變化不顯著(P>0.05, 圖1A)。肝組織HE染色結果顯示，相較于NS組，LPS組小鼠肝臟組織結構紊亂，有明顯的炎癥細胞浸潤和靜脈竇充血(圖1C)。進一步的F4/80 IHC染色結果顯示，相較于NS組，LPS組小鼠肝組織內巨噬細胞數量顯著增加(P<0.01，圖1D、1E)。此外，real time-PCR 結果表明，LPS組小鼠肝組織中IL-6 mRNA相對表達量顯著高于NS組(P<0.001，圖1F)。以上結果表明，LPS可成功誘導小鼠肝臟急性炎癥反應。

注：A. 肝臟質量；B. LI；C. 肝臟組織HE染色結果(×200)；D. 肝臟組織F4/80 IHC染色結果(×200)；E. F4/80陽性細胞半定量結果； F. real time-PCR檢測肝臟組織IL-6 mRNA表達情況。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖1 LPS誘導小鼠肝臟急性炎癥反應情況

3.2 LPS誘導小鼠急性肝損傷和肝細胞凋亡相較于NS組，LPS組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高(均P<0.05，圖2A、2B)，提示小鼠發生明顯肝細胞損傷。進一步的TUNEL染色結果顯示，LPS組小鼠肝臟組織中TUNEL陽性肝細胞數顯著多于對照組(P<0.001，圖2C、2D)，提示LPS可致肝細胞凋亡。

3.3 LPS抑制小鼠肝細胞SIRT2mRNA及蛋白的表達IHC染色發現，LPS刺激后小鼠肝細胞中SIRT2蛋白的表達量明顯下降(圖2E)。進一步的real time-PCR和Western blotting檢測結果顯示，LPS顯著下調小鼠肝細胞SIRT2 mRNA及蛋白表達水平(P<0.01，圖2F、2G)。

3.4 體外LPS刺激不影響肝細胞系凋亡及SIRT2表達分別接種適量AML12細胞于96、12和6孔板，經16 h貼壁培養后，將LPS按0.0、0.5、1.0 mg/L質量濃度梯度處理AML12細胞。24 h后的CCK8檢測結果顯示，不同濃度LPS對AML12細胞的增殖能力并無顯著影響(P>0.05, 圖3A)；同時real time-PCR和Western blotting檢測結果顯示，不同濃度LPS對AML12細胞SIRT2 mRNA和蛋白質的表達也無顯著影響(P>0.05, 圖3B、3C)。這些結果與動物在體實驗結果完全不同。

3.5 LPS通過巨噬細胞抑制AML12SIRT2表達由于在體條件下小鼠肝臟中存在多種細胞的相互作用，而體外培養肝細胞系缺乏這種相互作用。因此，筆者提出假設：LPS對肝細胞凋亡及SIRT2表達的調控之所以存在體內外差異，可能是在體條件下LPS通過影響其他類型細胞下調了肝細胞SIRT2的表達并促進其凋亡。LPS的主要靶細胞是巨噬細胞，因此，研究分別使用0.0、0.5、1.0 mg/L質量濃度梯度LPS刺激小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 6 h。離心、收集上清液再混合新鮮培養液處理AML12細胞24 h后(圖4A)，提取AML12細胞的RNA和蛋白質。real time-PCR和Western blotting檢測結果顯示，1.0 mg/L LPS刺激后，RAW264.7細胞上清液可顯著下調AML12細胞SIRT2 mRNA(P<0.05，圖4B)和蛋白(圖4C)表達水平，這與在體實驗結果一致。

注：A. 血清ALT檢測結果；B. 血清AST檢測結果；C. 肝臟組織TUNEL IHC染色結果(×200，紅色箭頭所指為TUNEL陽性細胞)；D. TUNEL染色陽性細胞數半定量結果；E. 肝臟組織SIRT2 IHC染色結果(×200)；F. real-time PCR檢測肝臟組織SIRT2 mRNA表達情況；G. Western blotting檢測肝臟組織SIRT2蛋白表達情況。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2 LPS對小鼠肝細胞損傷、凋亡及SIRT2表達的影響

注：A. CCK8檢測結果；B. real time-PCR檢測SIRT2 mRNA表達情況；C. Western blotting檢測SIRT2蛋白表達情況。圖3 LPS對肝細胞系AML12增殖及SIRT2表達的影響

注： A. LPS作用下RAW 264.7和AML12相互作用關系實驗驗證流程圖；B. real time-PCR檢測SIRT2 mRNA表達情況；C. Western blotting檢測不同濃度LPS處理RAW264.7細胞6 h后其上清液刺激AML12細胞24 h SIRT2蛋白的表達情況。*P<0.05。圖4 巨噬細胞對LPS作用下肝細胞SIRT2表達的影響

3.6SIRT2敲減有助于LPS對AML12肝細胞增殖的抑制及凋亡的促進LPS通過巨噬細胞抑制肝細胞SIRT2的表達，提示SIRT2可能在肝細胞損傷中發揮一定作用。利用siRNA技術，課題組在AML12細胞中有效敲減SIRT2的表達(P<0.001，圖5A)。分別使用0.0、0.5、1.0 mg/L質量濃度梯度的LPS刺激處理后AML12細胞(AML12 siSIRT2)和對照細胞(AML12 siNC)24 h。CCK8檢測發現，siNC組細胞的增殖能力不受LPS濃度影響，但LPS可顯著抑制SIRT2敲減AML12細胞的增殖(P<0.05，圖5B)。Western blotting檢測結果發現，1.0 mg/L LPS作用下，SIRT2敲減可明顯增加凋亡標志蛋白cleaved Caspase3的表達(圖5C)。以上結果提示，SIRT2分子在LPS導致的肝損傷中發揮重要作用。

注： A. real time-PCR和Western blotting檢測siRNA敲減SIRT2的效率；B. siNC和siSIRT2AML12經不同濃度LPS刺激24 h后的CCK8檢測結果；C. Western blotting檢測siNC和siSIRT2AML12經1.0 mg/L LPS刺激24 h后cleaved Caspase3及SIRT2蛋白的表達水平。*P<0.05， **P<0.001。圖5 AML12細胞中SIRT2的敲減對LPS誘導的肝細胞增殖、凋亡的影響

4 討論

LPS是引起炎癥反應的關鍵因素，可誘導單核細胞、巨噬細胞、T細胞等合成和釋放各種細胞因子，介導內毒素性休克及多臟器功能衰竭的發生發展[7]。由于肝腸在解剖結構上聯系緊密，多種感染性疾病的致病菌和毒素首先累及的器官是肝臟[12]。

LPS造成肝臟組織損傷的機制十分復雜。LPS可結合巨噬細胞表面的TLR復合物激活經典的LPS通路，誘導IκBα和p65磷酸化，磷酸化的p65入核促進炎性因子相關基因的轉錄和表達[13]。同時，LPS可誘導肝細胞發生過度的氧化應激，導致活性氧類的過量產生并激活Keap1-Nrf2信號通路[14]。此外，LPS也可通過刺激免疫細胞釋放細胞因子損傷肝臟組織[15]。本研究發現，LPS可誘導小鼠肝臟炎癥反應和肝細胞凋亡，同時肝細胞中SIRT2蛋白表達量顯著下調。但矛盾的是，體外研究并沒有觀察到類似現象，即LPS無法直接影響AML12肝細胞增殖，且對SIRT2的表達沒有影響。基于肝臟中多細胞間相互作用在臟器病理生理學中發揮重要作用，研究以小鼠單核巨噬細胞RAW264.7(已知的LPS靶細胞)為研究對象，經共培養實驗發現，LPS刺激RAW264.7后的細胞上清液可顯著抑制AML12肝細胞中SIRT2的表達(P<0.05， 圖4B、4C)。同時，敲減SIRT2的AML12細胞經LPS刺激后發生顯著的增殖抑制(P<0.05)和凋亡促進。以上結果提示，LPS可通過作用于肝臟巨噬細胞下調肝細胞SIRT2的表達，而SIRT2表達的減少可增加LPS對肝細胞增殖的抑制(圖5B)，誘導肝細胞凋亡，從而促進LPS導致的肝損傷。本研究是對LPS引起的急性肝臟損傷作用機制的新探索。由于是體外研究，故LPS對SIRT2表達的影響(圖4)是否在小鼠及人體中也發揮同樣的作用有待進一步研究。