金屬免疫學研究進展

衛瀟茗，王晨光，張睿，呂夢澤，蔣爭凡

(1.北京大學生命科學學院 細胞分化與增殖教育部重點實驗室，北京 100871；2.北大-清華生命科學聯合中心，北京 100871)

金屬元素是生命體的重要組成部分。金屬離子及金屬蛋白在很多生命過程中都發揮重要的作用，但人們對其作用機制的研究還非常少。金屬離子是許多蛋白的重要組分。在所有已知的酶中，約有三分之一的酶具有金屬輔因子，后者構成酶的結構，可催化組分或調控酶功能[1]。金屬元素(離子)調控功能的基礎在于它們不同的亞細胞分布。帶電荷的金屬離子依賴于膜上的載體蛋白或通道蛋白進行跨膜流動，很容易建立跨膜濃度梯度。絕大多數的金屬離子通過主動運輸進出細胞，其濃度在短時間內能發生幾個數量級的顯著改變。由于機體在應對突發的感染時需要迅速地進行免疫應答，所以金屬離子非常適合作為免疫系統的信號傳遞體。一些離子通道病患者體內免疫細胞功能發生顯著失調，表明維持金屬離子的穩態是保持免疫系統功能正常的先決條件。事實上，人們早已開展了對金屬離子調節免疫系統的研究，如形形色色的金屬過敏的發現。1950年大規模出現的金屬鎳接觸性皮炎是最為多發和最著名的超敏反應。鎳離子通過結合TLR4激活巨噬細胞，釋放IL和IFN并激發T細胞免疫[2]。又如1926年發現并開始在全球使用的鋁佐劑。近年來，關于金屬元素在免疫系統中的功能的報道越來越多，使人們對金屬免疫學的認識越發深入[3]。

1 錳

1.1 錳的穩態錳是一種人體必需的微量元素。細胞中的錳主要以離子形式貯存在線粒體、高爾基體和細胞核中，多余的錳則以不可溶的磷酸鹽或碳酸鹽形式存在。食源性的錳缺乏癥在臨床上很少見，因而關于錳穩態失調的研究多在實驗條件下或基因突變個體中進行。飲食錳限制的動物體內會出現多種缺陷或異常，而急性錳中毒也會導致疾病的發生；slc39a14基因的缺陷會造成高錳血癥，在此類患者中常見兒童期急性發作的帕金森癥肌張力障礙及神經退行性病變[4]；slc39a8基因的錯義突變會造成循環中的錳濃度降低，該突變與青少年特發性脊柱側彎存在關聯[5]。值得注意的是，錳離子與鈣、鎂離子具有密切的聯系。錳離子的離子半徑介于鈣、鎂離子之間；錳離子能結合鈣離子結合位點和鎂離子結合位點；錳離子經常能在生物過程中替代鈣、鎂離子的功能，在體外試驗中錳離子的替代通常使鎂離子催化酶具有更高的活性[6-8]。細胞中似乎存在著鎂催化和錳催化2種相似但不相同的催化“菜單”，對于大多數以鎂離子為催化核心的酶，同樣可以使用錳離子參與催化相似的生化反應，但鎂、錳離子的不同，可能會帶來顯著不同的酶促動力學特性。如生物圈里含量最多的蛋白——核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，其在鎂離子存在的情況下更有利于底物的羧化并產生乙醇酸；在錳離子存在的情況下則更有利于底物的氧化并產生乙醇酸和丙酮酸，而后者可以刺激蘋果酸的產生，并為硝酸鹽同化等能量密集的生化過程提供還原力[9]。

1.2 錳與營養免疫在很長一段時間內，對錳在免疫系統中的功能研究聚焦在營養免疫中。人們發現，機體能夠通過限制病原菌攝入鐵、錳和鋅等營養元素來阻止感染的發生。如宿主采取不同的手段限制病原菌獲得錳：針對胞外菌，中性粒細胞能夠通過釋放鈣衛蛋白來螯合錳和鋅[10]，鈣衛蛋白缺陷小鼠對于多種病原菌的抵抗力變弱[11]；胞內的天然耐藥相關巨噬細胞蛋白1能將錳從吞噬溶酶體中轉運出去，從而限制被吞噬的病原菌獲得錳[12]。為了得到更多的錳，病原菌上調了錳轉入蛋白家族(MntABC及MntH等)的表達量[13]。由此可見，在宿主細胞與病原菌的斗爭中，對于錳的爭奪成為了制勝的關鍵因素之一。

1.3 錳離子和Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3(Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3，NLRP3)炎癥小體通路錳離子能夠激活NLRP3炎癥小體通路，促進促炎因子IL-1β等的表達[14]，也能夠促進包含凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)的外泌體的分泌，進而在細胞間激活炎癥反應。因職業原因處于錳暴露的人群，其血漿外泌體中含有更多的ASC[15-16]。錳離子的這種激活性質也具有其他的應用潛力。本課題組近期的研究發現，錳離子激活NLRP3炎癥小體依賴于活性氧自由基的產生、鈣離子的釋放和鉀離子的外流，不依賴于線粒體DNA的釋放或固體顆粒的形成；更有趣的是，錳離子激活炎癥小體會引發消皮素D(gasdermin D, GSDMD)依賴的細胞焦亡，但并不引起促炎因子IL-1β、IL-18的成熟和釋放，這也是后文所提及的錳離子佐劑的毒副作用遠低于一些含有LPS佐劑的一個可能原因。

1.4 錳離子和環鳥苷酸-腺苷酸合酶(cyclic guanosime monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS)-干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon gene，STING)通路錳離子具有類似于鈣離子的“第二信使”功能。病毒感染所引發的宿主細胞線粒體膜電位的喪失及細胞器的酸化，導致細胞器中的錳離子向細胞質及細胞外釋放：細胞質中累積的錳離子激活cGAS-STING通路，產生大量的Ⅰ型IFN；向細胞外釋放的錳離子通過循環系統被遠處的巨噬細胞、DC及淋巴細胞攝取，激活這些細胞的天然免疫反應。體外試驗表明，少量的錳離子可以上萬倍地提高cGAS對病毒DNA的監測能力，同時顯著提高cGAS合成環鳥苷酸-腺苷酸(cyclic guanosime monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP)的能力。此外，錳離子可以數百倍地增強STING對cGAMP的結合能力。這樣，錳離子數千倍地提升了細胞對細胞質DNA(來自于病毒、腫瘤細胞或受損細胞)的敏感性。更重要的是，當缺少錳元素時，小鼠對DNA病毒的抵抗能力顯著下降[17]。這項工作提示，錳離子具有警報素的功能。在鄰近感染中心的細胞中，濃度升高的錳離子可以使cGAS在正常的細胞質/細胞核dsDNA濃度下被激活[18]，從而使機體在感染尚未發生時預先進入抗病毒狀態。最近發表的工作以及本課題組的研究進一步證明，錳離子甚至能夠不依賴于dsDNA而獨立激活cGAS[19]；錳離子-cGAS結構中cGAS蛋白發生的構象變化，總體類似于DNA-cGAS中cGAS的構象變化，但催化中心的結構顯著不同，而且錳離子活化的cGAS合成cGAMP的方式與DNA活化的cGAS顯著不同[20]。

1.5 錳的其他免疫調節特性在以往的研究中，人們發現錳還具有一些其他的免疫調節特性：腹腔注射MnCl2能夠增強年幼小鼠體內NK細胞的活性[21]；錳離子能夠強化T細胞與APC的結合[22]；錳離子能夠促進志賀毒素的降解[23]；錳離子能夠激活共濟失調毛細血管擴張突變-抑癌轉錄因子p53(ataxia telangiectasia mutated-p53，ATM-p53)信號通路[24]。

綜合錳離子多樣的免疫激活特性，本課題組提出錳離子作為危險相關分子模式(danger-associated molecular pattern，DAMP)或警報素的工作模型(圖1)。錳離子的貯存和濃度梯度的維持是需要耗能的主動過程，而其釋放則是被動的。病原體感染細胞時通常會劫持細胞中的代謝系統，使錳離子的穩態遭到破壞。感染引起的釋放使錳離子從感染中心向外降低的濃度梯度得以建立。在最鄰近感染的細胞中，發生了天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase， Caspase)的級聯激活和細胞凋亡。次鄰近感染的細胞中發生了ATM-p53通路及NLRP3炎癥小體通路的活化，使得輕微的感染也能引起細胞凋亡或細胞焦亡的發生。在稍遠的細胞中，Ⅰ型IFN及多種抗感染細胞因子(包括炎性因子、趨化因子)大量表達。在更遠的細胞中，則會出現cGAS-STING通路的預活化。在前2種情況下，發生的是預防感染蔓延的細胞死亡；而在后2種情況下，則是為可能發生的感染提前做好充足的準備。因為病原體具有多種逃逸免疫系統主動防御的機制，所以監測細胞中穩態或完整性喪失的被動防御機制十分重要。各種不同的防御機制相互配合更有利于機體抵抗病原體的侵入和破壞。

注：ISG為干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene)。圖1 錳離子作為DAMP或警報素的工作模型

1.6 錳離子激活天然免疫的實際應用免疫佐劑可以增強機體對抗原的免疫應答反應，減少疫苗中抗原的使用量，產生更強的免疫保護作用和更長時程的免疫記憶，從而提升疫苗效果。此外，免疫佐劑還被廣泛用于各種治療性疫苗，特別是腫瘤的個性化免疫疫苗中。

自1926年英國免疫學家Alexander Glenny發現用硫酸鋁鉀沉淀的白喉桿菌毒素能促進抗體產生以來，鋁佐劑(氫氧化鋁或磷酸鋁)是目前為止全球唯一被廣泛使用的人用佐劑。但鋁佐劑存在很多問題，最主要的是：(1)鋁佐劑效率較低且只能引發以抗體生成為標志的體液免疫反應，而對細胞免疫的活化作用微弱，無法用于抗病毒、抗腫瘤這類需要活化細胞免疫的疫苗;(2)低溫條件下鋁佐劑會失去膠體屬性，其佐劑效果受到破壞，因此含鋁佐劑的疫苗無法以凍干粉形式儲存和運輸。而其他實驗性質的免疫佐劑由于生物安全性和成本的原因，也很難大規模推廣和應用。

作為一種強效的天然免疫激動劑，錳離子可誘導細胞產生大量的包括Ⅰ型IFN在內的細胞因子，使其具有成為佐劑的潛質。基于此，本課題組開發了一種具有膠體性質的納米錳佐劑。體內外的研究發現，納米錳佐劑具有許多優異的性質：(1)可強烈激活細胞免疫(尤其是CTL)，用于抗腫瘤、抗病毒的臨床與生產實踐；(2)可激活體液免疫，產生高濃度抗體；(3)可強烈促進DC成熟，誘導機體針對免疫原性弱、其他佐劑無能為力的抗原產生抗體；(4)不激活系統性炎癥反應，無毒副作用；(5)可激活黏膜免疫，誘導產生高水平分泌型IgA，可作為黏膜免疫佐劑；(6)對多種抗原都有普遍適用性，包括滅活病毒、重組蛋白和肽段等。

腫瘤的免疫檢查點抑制劑治療是一個里程碑式的突破，是國際公認的最有應用前景的腫瘤治愈手段。2018年諾貝爾生理學或醫學獎授予詹姆斯·艾利森和本庶估這2位科學家，以表彰他們在該研究領域作出的貢獻。但腫瘤免疫治療存在重大的缺陷,腫瘤患者的響應率不到20%，其重要原因是患者免疫系統不能夠有效行使對腫瘤細胞的免疫監視。最近一系列的研究發現，cGAS-STING通路對于腫瘤細胞的免疫監視至關重要：腫瘤細胞DNA激活癌旁APC(主要是DC)的cGAS，產生Ⅰ型IFN，促進DC成熟并將腫瘤特異性抗原提呈給T、B細胞，激活CTL殺滅腫瘤細胞。因此，激活腫瘤患者體內的cGAS-STING通路將會極大地增強免疫檢查點抑制劑治療腫瘤的效果，高效激動劑的篩選和鑒定成為世界各大制藥公司的重要目標[25]。錳離子作為一種簡單而強效、幾乎無成本的cGAS-STING激動劑，也因此有了更大的臨床應用潛力。本課題組研究發現，錳離子對于抗腫瘤免疫具有重要的意義：一方面，錳離子對于體內正常生理狀態下腫瘤的免疫監視十分重要；另一方面，錳離子能夠促進DC的成熟和腫瘤特異性抗原的提呈，并增強CD8+T細胞的分化和激活。錳離子與免疫檢查點抑制劑或化療藥物聯用在多種腫瘤模型中都顯示出非常好的協同效果，并顯著減少了抗PD-1抗體或化療藥物的用量[26]。綜合上述結果，認為腫瘤的免疫治療就像車輛駕駛：既需要“松剎車”(免疫檢查點抑制劑)，又需要“踩油門”(cGAS-STING激動劑，錳離子)，兩者都非常重要，甚至缺一不可(圖2、圖3)。單純的免疫檢查點抑制劑治療只是“松剎車”，沒有“踩油門”，因此患者的響應率不高。與之一致的是，最近有研究者開發了一種基于錳的納米顆粒用于腫瘤的治療[27]。這種納米藥物能夠在腫瘤處釋放阿霉素(誘導DNA損傷)和錳離子，其在小鼠腫瘤模型中具有較好的治療效果。由于錳離子成本極低，其在顯著促進療效的同時，還可降低腫瘤治療特別是腫瘤免疫治療的成本，這將會極大地降低國家和患者的負擔。同時，基于錳佐劑所制備的抗病毒、抗腫瘤疫苗，具有極大的臨床應用潛力，有望在不久的將來惠及國計民生。

圖2 腫瘤免疫治療的雙控系統

圖3 錳離子+免疫檢查點抑制劑治療原理示意圖

2 鈣

2.1 鈣的穩態人體內鈣的含量非常豐富，其中絕大部分分布于骨骼和牙齒中。靜息狀態下，細胞內的鈣離子主要貯存在內質網中，細胞質中游離的鈣離子濃度遠低于細胞外；當細胞被激活時，細胞內鈣離子濃度會迅速升高。鈣離子在免疫系統中發揮著重要的作用[28]。實驗證據及人類基因組數據表明，鈣離子通道ORAI1或STIM1的缺陷會阻礙鈣離子流入細胞，導致免疫缺陷、無汗性外胚層發育不良、經典型卡波西肉瘤等疾病的發生[29-30]。另有研究發現，鈣庫操縱的鈣離子內流影響著濾泡輔助性T細胞的分化和功能，其缺陷可能導致靜息狀態下自身抗體的產生以及感染時病原特異性抗體的缺乏[31]。

2.2 鈣和活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cell，NFAT)信號通路鈣離子作為第二信使在淋巴細胞的發育及功能調控中發揮著重要的作用。使用鈣離子-NFAT信號通路中鈣調磷酸酶抑制劑CsA處理細胞，會導致CD4/CD8雙陽性T細胞向CD4+或CD8+單陽性T細胞的轉變過程受損[32]。同時，鈣調磷酸酶缺陷的小鼠體內成熟的單陽性T細胞明顯少于野生型小鼠，表明該通路對于T細胞發育成為具有MHC限制性和自我耐受性的成熟T細胞具有重要作用[33]。鈣離子-NFAT通路也能夠調控CTL及Treg等T細胞的活性，從而分別影響T細胞對病毒感染細胞和腫瘤細胞的殺傷作用及T細胞的失能和耐受等[34-35]。

2.3 鈣在免疫系統中的其他功能近年來的研究發現，鈣離子也參與其他免疫信號通路。NLRP3炎癥小體的激活可能需要鈣離子的參與。NLRP3炎癥小體通路可以被許多結構各異、性質不同的誘導物激活，鈣離子的動員和內流可能是一種通用的傳遞各種危險信號的機制[36]。另有研究發現，鈣離子通道STIM1能夠通過將STING滯留在內質網而調控cGAS-STING通路，表明鈣離子穩態可能在抗DNA病毒免疫中發揮作用[37]。總之，鈣作為一種人們熟知的第二信使在免疫系統中發揮著巨大的作用，而其更多的功能也在不斷地被發現和應用。

3 鐵

鐵是機體中血紅蛋白、肌紅蛋白和細胞色素還原酶等的重要輔基，它們依賴鐵進行氧化還原反應和電子傳遞。過量的鐵會通過Fenton反應產生活性氧自由基，從而對機體造成損害。鐵主要貯存在肝細胞以及肝、脾巨噬細胞中。鐵調素是機體中調控鐵穩態的激素。血液循環中的鐵含量上升會誘導鐵調素的表達，后者通過降解鐵轉運蛋白來降低鐵的含量；而循環中的鐵含量下降又能夠抑制鐵調素的表達，從而形成負反饋調節[38]。

鐵在營養免疫中發揮重要的作用。當胞外病原菌感染機體時，感染所引發的炎癥反應會誘導鐵調素的產生，使血漿中的鐵含量下降，從而對胞外病原菌起到營養限制的作用。鐵調素缺陷小鼠血漿中鐵的含量不會在感染或炎癥發生時下降，這導致小鼠對多種胞外病原菌都更易感[39]。當發生胞內菌的感染時，機體也能夠采取相應的措施限制病原菌獲取鐵。如在吞噬了病原菌的巨噬細胞中鐵離子外流的通道會開放，使細胞中的鐵含量下降[40]。

除了營養免疫，鐵也參與了機體中的其他免疫反應。鐵影響著天然免疫反應：鐵能夠通過誘導活性氧中間體的產生來激活NF-κB通路[41]；而過量的鐵則會抑制信號轉導與轉錄激活因子1等轉錄因子的活性[42-43]。近年來，關于鐵死亡的研究使人們對鐵在腫瘤免疫中發揮的作用有了新的認知。研究發現，CD8+T細胞通過分泌IFN-γ來促進腫瘤細胞的鐵死亡，而抑制鐵死亡則會降低免疫治療的效果[44]。因此，誘導鐵死亡或許能夠成為一種新的腫瘤免疫治療的手段。

4 其他金屬元素在免疫系統中的功能

其他多種金屬元素也參與了機體中的免疫反應。鋅能夠調控單核細胞、巨噬細胞、DC、B細胞和T細胞等多種免疫細胞的發育和功能。如鋅離子的內流參與TCR信號通路的激活并促進T細胞成熟[45]。最近的研究發現，鋅離子可能通過促進cGAS-DNA相分離的發生來提升cGAS的酶活性，從而協助cGAS-STING通路的激活[46]。鉀離子的外流在多種誘導物激活的NLRP3炎癥小體通路中被檢測到[47]，而鉀的穩態可能也影響了cGAS-STING通路的激活[48]。在腫瘤的化療中也有金屬元素的應用，如順鉑作為化療藥物在臨床上被用于多種實體瘤的治療[49]。

5 展望

金屬免疫學作為一個全新的前沿交叉學科正初露端倪并迅速成長，具有充足的發展潛力和廣闊的發展前景。金屬元素在免疫應答及腫瘤免疫治療中的價值正在被逐漸挖掘出來。多種含金屬元素的納米顆粒或以金屬酶及離子通道為靶點的藥物受到人們的廣泛關注。相信在不久的將來，金屬免疫學的相關研究會取得長足的進展，而其應用也會更好地造福于人類社會。雖然近年來金屬免疫學的發展勢頭良好，但是想要取得更多突破性的進展則必須依賴于技術工具的進步。鈣作為迄今為止研究得最為清楚的金屬元素之一，其研究的進步很大程度上依賴于特異性熒光探針及螯合劑的開發。很多金屬元素都缺乏特異性的探針或螯合劑，這使得在進行相應的研究時不能很好地與其他金屬元素區別開。進行這類研究時只能采用一些間接的方法，如使用廣譜抑制劑處理后再添加感興趣的金屬離子，或使用目標金屬元素缺乏的培養基等。如果有特異性的探針或抑制劑，則能夠提供更加直接的證據。其次，構建金屬離子通道蛋白缺陷或金屬元素食源性限制的動物模型也是十分重要的。這些動物模型的應用將從組織器官乃至個體水平上提供強有力的實驗證據。此外，隨著全基因組測序技術及單細胞測序技術等測序工具的發展，金屬元素穩態失調個體中免疫系統功能的完整性將會得到深入的挖掘。針對這些問題的研究將是生命科學與醫學、化學的天然交叉點，具有重要的理論意義和實用價值。金屬免疫學將為免疫學的研究提供新的思路及新的技術方法，也將為基于免疫原理的臨床治療開拓新的途徑。