林蛙油凍干粉對大鼠肺纖維化藥理作用及其機制的研究

李孟，呂邵娃，管慶霞，郭玉巖，楊炳友,張鳳春，李永吉，匡海學*

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江四寶生物科技股份有限公司，黑龍江 鐵力 152500)

2020年新型冠狀病毒感染的肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)在全世界范圍內肆虐，《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第八版)》[1-2]指出感染者的胸部影像學特點：早期呈多發小斑片影像伴有間質改變，肺外帶處明顯，可進一步發展為雙肺多發磨玻璃樣浸潤影。研究顯示[3]，基礎病明確的患者影像中，多呈現為雙肺彌漫性病變，少數表現為“白肺”樣，并伴多發條索狀陰影，由于急性期大量肺間質炎性滲出，會造成嚴重的肺部纖維化[4-5]，肺纖維化也是老年人常見的一種難以治愈的疾病。因此，改善肺纖維化是有效的緩解癥狀的方式及治療的手段。林蛙油別名哈士膜油，是東北地區特色藥材，為林蛙的干燥輸卵管，收載于歷年的《中國藥典》之中，具有補腎填精、養陰潤肺的作用，根據黑龍江省七臺河市人民醫院和牡丹江紅旗醫院等臨床報告顯示，對新冠肺炎的患者給予林蛙油凍干粉輔助治療，對體質虛弱、癆嗽咳血等癥效果顯著，還可以改善陰虛體弱、神疲乏力、心悸失眠等。然而林蛙油凍干粉是否具有改善肺纖維化的作用未見報道，本文以林蛙油凍干粉[6]為研究對象，考察林蛙油凍干粉對大鼠肺纖維化的藥理作用，為林蛙油凍干粉臨床防治肺纖維化疾病的提供一定的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD品系大鼠，體質量200～220 g。青島市實驗動物和動物實驗中心提供，合格證號為SCXK(魯)20140001。

1.2 藥物與試劑

林蛙油凍干粉(黑龍江四寶生物科技股份有限公司，批號20191101)；HYP試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；MDA試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；SOD試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；GSH-Px試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；CAT試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；TNF-α試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；IL-6試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)；IL-7試劑盒(美國R&D Systems公司，ELA05990)。

1.3 實驗儀器

101A-1E型電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器有限公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FA2004分析電子天平(上海良平儀器儀表)；VICTOR X3酶標儀(PerkinElmer公司)；TDL-4型低速臺式離心機(上海安享科學儀器廠)；108 mL手動組織勻漿器(天津玻璃儀器廠)；H2050R型臺式高速冷凍離心機(湖南實驗室儀器開發有限公司)。

1.4 分組與給藥

取雄性SD大鼠63只，隨機分為7組。實驗室內溫度保持在(22±2)℃，相對濕度55%～75%，光照時間隨自然變化。大鼠均以基礎飼料和蒸餾水常規飼養，自由飲食，實驗大鼠適應性飼養1周后進行實驗。隨機分為：①正常對照組(生理鹽水灌胃1 mL/d),②假手術組(生理鹽水灌胃1 mL/d),③模型組(博萊霉素5 mg/kg),④林蛙油凍干粉低劑量干預組(0.05 g/kg林蛙油凍干粉混懸液),⑤林蛙油凍干粉中劑量干預組(0.10 g/kg林蛙油凍干粉混懸液),⑥林蛙油凍干粉高劑量干預組(0.20 g/kg林蛙油凍干粉混懸液),⑦潑尼松組(0.005 g/kg)。

②～⑦組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)，大鼠麻醉后，切開頸正中部位并暴露氣管，③～⑦組由氣管向內注入溶解了博萊霉素A5(5 mg/kg)的生理鹽水0.2 mL，向②組注入等量生理鹽水，然后各組大鼠均直立并旋轉，使藥液均勻分布在肺內。次日，①～③組2 mL生理鹽水灌胃，④～⑦組灌胃給藥，每日1次。

1.5 觀察指標

血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度測定，肺組織MDA、SOD、GSH-Px、CAT 含量的測定，同時觀察肺纖維化大鼠肺組織病理學改變和HYP水平的變化情況。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 林蛙油凍干粉對肺纖維化大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17濃度的影響

灌胃28 d后，大鼠麻醉后開胸，以心臟采血法采集血液3 mL，離心并提取血清， ELISA法測定各組血清TNF-α、IL-6、IL-17 濃度。結果見表1。

表1 各組間血清TNF-α、IL-6、IL-17含量變化情況比較

從表1可知：模型組與正常對照組、假手術組比較， TNF-α含量、IL-6含量、IL-17含量升高并有顯著性差異，證明其造模成功。

林蛙油凍干粉各給藥組與模型組比較，TNF-α含量降低且有統計學意義(P<0.05)，表明林蛙油凍干粉可以明顯減少炎癥的發生，抑制致炎因子TNF-α的表達。IL-6含量降低均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，表明林蛙油凍干粉可以明顯抑制致炎因子IL-6的表達。IL-17含量降低具有統計學意義(P<0.05)，表明林蛙油凍干粉高劑量組可明顯降低炎癥細胞因子IL-17的產生。

2.2 肺組織MDA、SOD、GSH-Px、CAT 含量的測定

頸動脈放血將大鼠處死，取右側肺部組織后迅速置于-80 ℃液氮中凍存，檢測丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)含量。檢測時，取適量右肺組織勻漿，離心，提取上清液，測定MDA、SOD、GSH-Px、CAT的含量。結果見表2。

表2 各組肺組織MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量變化情況比較比較

結果表明：模型組與正常對照組、假手術組比較，MDA含量升高并具有顯著性差異。林蛙油凍干粉各給藥組與模型組比較，含量降低且均有統計學意義(P<0.05)，表明林蛙油凍干粉組對肺系統損傷程度有明顯降低作用。林蛙油凍干粉低劑量組與模型組比較，SOD含量升高且具有統計學意義(P<0.05)，表明林蛙油凍干粉低劑量組可明顯消除生物體在新陳代謝中產生的有害物質。林蛙油凍干粉中劑量和高劑量組與模型組比較，GSH-Px含量升高并具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，表明林蛙油凍干粉中劑量和高劑量可以保護細胞膜結構和功能；CAT含量升高并具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，表明林蛙油凍干粉清除自由基能力強，具有保護細胞免受自由基的損傷的作用。

2.3 林蛙油凍干粉對肺纖維化大鼠肺組織病理學改變和HYP含量的影響

將10 %中性福爾馬林液經主支氣管注入左肺，并使胸膜展開。而后將其放入10 %中性福爾馬林液中固定24 h以上，用石蠟包埋，切片，HE染色及Masson染色[7]。用HE染色評定肺組織肺泡的炎癥程度：0分為無肺部組織炎；1分為輕度的肺部組織炎，炎性細胞浸潤僅為局部或近胸膜部，其面積小于全肺的20%；2分為中度肺部組織炎，其炎性受累面積約占全肺地20%～50%；3分為重度肺部組織炎，其受累的面積大于50%。Masson染色評定肺組織纖維化程度：0分：無肺纖維化；1分：輕度肺纖維化，受累面積少于全肺20%；2分：中度肺纖維化，受累面積占20%～50%；3分：重度肺纖維化，受累面積大于50%，肺泡結構紊亂。結果見圖1和圖2。取適量右肺組織勻漿，離心，提取上清液，采用試劑盒測定HYP含量，見表3。

表3 肺部炎癥和纖維化的比較分數和HYP含量

圖1和圖2結果表明：正常對照組、假手術組的大鼠肺部組織結構清晰，無病理改變；模型組的肺泡間隔明顯地增厚，多數大鼠肺泡壁的結構紊亂，較多炎癥細胞浸潤，肺部纖維化明顯；林蛙油凍干粉組上述病變明顯減輕。

注：A:正常對照組B:假手術組C:模型組D:林蛙油凍干粉低劑量組E:林蛙油凍干粉中劑量組F:林蛙油凍干粉高劑量組G:潑尼松組。圖1 HE肺組織染色圖(×20)

注：A：正常對照組 B：假手術組 C：模型組 D：林蛙油凍干粉低劑量組 E：林蛙油凍干粉中劑量組 F：林蛙油凍干粉高劑量組G：潑尼松組。圖2 Masson肺組織染色圖(×20)

由表3可知，林蛙油凍干粉低劑量和中劑量組與模型組比較，肺泡炎、肺纖維化評分及肺組織HYP含量均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明林蛙油凍干粉低劑量和中劑量組可減輕肺纖維化及肺泡炎程度。

3 討論

肺纖維化是由多種肺內外致病因素所導致的慢性、間質性肺疾病，是一種致命的肺部疾病，病理表現為肺泡上皮細胞的損傷和異常增殖，大量細胞外基質的沉積和成纖維細胞的增殖和活化[8-10]，導致肺部結構破壞和呼吸功能的喪失。肺纖維化的死亡率較高，據近5年數據顯示，患者的平均生存周期僅為2.8 年，死亡率較大多數腫瘤疾病高，有“類腫瘤疾病”[11]之稱。肺纖維化的形成和發展過程復雜，機制不明，但既往的研究提示氧化應激和過度炎癥反應在其疾病的發展中具有重要作用[12]。近年來，肺纖維化發病率呈上升趨勢，因此尋找安全有效藥物治療已成為迫切需要。

TNF-α可誘導T細胞產生多種炎癥因子[13]，激發炎癥的產生。IL-6、IL-17是由多種細胞產生并作用于的一類細胞因子，能在急性炎癥反應中誘導急性期地反應蛋白合成。這幾類均為導致肺損傷地重要的致炎因子，抑制其產生能夠在一定程度上緩解肺纖維化炎癥細胞浸潤、活化，改善細胞因子異常分泌，以及肺部纖維化的病理過程。林蛙油凍干粉可有效抑制TNF-α的產生，明顯減緩肺纖維化炎癥細胞活性。

丙二醛是脂質過氧化反應時產生的代謝產物，當機體發生氧化應激時，自由基產生過多，超過了機體的清除能力，使氧化/抗氧化處于失衡狀態。MDA的含量可反映機體內脂質過氧化的程度。林蛙油凍干粉可有效降低機體MDA的含量，對系統損傷程度有明顯降低作用。

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶都是內源性抗氧化酶，可反映機體清除氧化自由基的能力。GSH-Px作為體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，當與一定物質結合后，可把機體內有害物質轉為無害物質，并將其排出體外。CAT的主要作用就是將H2O2催化分解變成H2O與O2，使H2O2不至于與O2反應產生有害的·OH，能夠對機體產生保護作用。林蛙油凍干粉可使細胞SOD含量、GSH-Px含量、CAT含量升高，可明顯消除生物體在新陳代謝中產生的有害物質，可保護細胞膜結構和功能，清除自由基的能力變強，具有保護細胞免受自由基損傷的作用。

羥脯胺酸是脯氨酸羥化酶催化前α-肽鏈中脯氨酸殘基而形成，主要存在于膠原中，當體內結締組織大量增生或破壞時均可造成血、尿中羥脯氨酸含量的增加，因此羥脯氨酸含量降低可代表炎癥癥狀減輕。林蛙油凍干粉可使HYP含量明顯降低，具有減輕肺纖維化及肺泡炎的積極意義。

現代藥理學研究表明林蛙油具有抗衰老、抗疲勞等藥理作用[14-16]。還可提高機體免疫功能和應激性能，含有極其豐富的 Vit E[17]。林蛙油本身就具有多種使用方法，除燉服外,口服需泡發后使用，泡發周期長，而林蛙油凍干粉更是質地疏松，泡發后迅速膨脹為原始體積的100倍以上，經多方實驗參數所制得的林蛙油凍干粉具有含水量低、復水性好、質量穩定、使用方便等特點。林蛙油凍干粉為林蛙油的廣泛應用提供了更為便捷、更為有效的途徑。

本研究結果表明，林蛙油凍干粉可在一定程度抑制肺纖維化的發生發展，其機制與減輕炎癥反應同時增強機體抗氧化能力有關，該結果的揭示為臨床的用藥提供了藥理學的依據。雖然目前尚缺乏針對新冠肺炎后肺間質纖維化傾向地大樣本的臨床研究，但本文為探討林蛙油治療新冠肺炎后肺間質纖維化傾向疾病提供了理論支持。