小鼠外翻腸囊法初探左金丸中季胺型生物堿的腸吸收特性

吳迪,高原,楊娜娜,韓曉宇,劉樹森,孫文斌,王旭,徐蓓蕾*

(1.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.北京鑫開元醫藥科技有限公司，北京 101102)

左金丸出自《丹溪心法·火六》，主治肝經火旺之證，后世醫家多用于肝火犯胃、胃氣上逆之脅肋脹痛、嘔吐吞酸、噯氣口干、舌紅苔黃、脈象弦數等癥[1]。伍曙霞[2]研究表明,左金丸結合養胃湯可以用來治療慢性萎縮性胃炎，并具有明顯的治愈效果。常用于治療肝火犯胃，肝胃不和證。現代臨床多用于胃炎、食道炎、胃潰瘍等屬肝火犯胃者。本次實驗主要針對左金丸中的季胺型生物堿進行研究，考察其在小鼠腸囊中的吸收特性。

1 材料

1.1 動物

ICR小鼠，雄性，體質量(20±2)g，購自長春億斯實驗動物技術有限公司，合格證編號：20180613。

1.2 藥物與試劑

黃連、吳茱萸藥材購自哈爾濱三棵樹藥材市場；小檗堿、藥根堿、巴馬汀對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為：120620、120423、110311；乙腈、甲醇為Merck公司，色譜純。

1.3 儀器

高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific)；紫外檢測器(UltiMate?3000 ECD3000RS)；電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司，DK-98-11A)。

2 方法

2.1 K-R試液(腸液)的配置

精確稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，溶解定容至1 000 mL容量瓶中，用稀鹽酸調節pH至7.0～7.2[3]。

2.2 對照品溶液制備

取小檗堿、藥根堿對照品適量，加入適量的甲醇，制成濃度為0.00 5 mg/mL、0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL的對照品備用；取巴馬汀對照品適量，加入適量的甲醇，制成濃度為0.00 1mg/mL、0.00 5 mg/mL、0.01 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL的對照品備用。

2.3 左金丸藥液制備

按黃連和吳茱萸的比例為6:1稱取生藥，先用10倍蒸餾水浸泡0.5 h，熬制1 h后，將濾液濾出，后加入8倍量的蒸餾水繼續熬制0.5 h，后將藥液濾出，與之前濾出的藥液混合，蒸發濃縮后熬制成浸膏[4]。將浸膏溶于Krebs-Ringer’s試液中，得到濃度分別為 422.74、211.37、105.685 mg/mL的左金丸藥液，作為本實驗的高、中、低劑量組。

2.4 HPLC色譜條件

高效液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，按每100 mL/0.4 g十二烷基硫酸鈉，溶于比例為50∶50的乙腈和水的混合溶液中，用磷酸調節pH值至4.0，形成以乙腈-水(含0.05 mol/L磷酸二氫鉀)溶液的流動相。選擇吸收度最大的345 nm波長作為測定波長。

2.5 外翻腸囊法測定小腸吸收面積

ICR小鼠實驗前禁食不禁水12 h，稱重，以水合氯醛麻醉，沿小鼠的腹中線和腹白線剖開，迅速將整個腸段離體，清理腸表面組織和血管。將腸道分段成5～7 cm左右4個腸段，用37 ℃的Krebs-Ringer’s試液進行沖洗，至腸內無內容物為止。將腸段翻轉，用冰冷Krebs-Ringer’s試液沖洗腸段表面，將腸段固定，另一端用絲線扎緊，形成腸囊。在腸囊中注入1 mL左右的37 ℃ Krebs-Ringer’s試液，將腸囊放至37 ℃ Krebs-Ringer’s試液EP管中，平衡五分鐘[5]。后放入含不同濃度的左金丸Krebs-Ringer’s溶液的EP管中，通入95%的O2與5%的CO2混合氣體，調節氣流0.02 MPa。實驗需在37 ℃恒溫水浴鍋中進行，分別在0 min、20 min、40 min、60 min、90 min取樣200 μL后，補充等體積的空白37 ℃的Krebs-Ringer’s試液。抽取腸囊內的樣品后過0.22 μm有機濾膜，在-20 ℃溫度下保存。實驗結束后，記錄每段腸囊的吸收面積A。

2.6 數據分析

累計藥物吸收量公式[6]：

其中Q為各時間的累積藥物吸收量，Cn為各時間點取樣的實際檢測濃度(μg/mL)，V0為平衡前腸管中加入的臺氏液體積(mL)，V為每次取樣的體積(mL)，L為藥物的累積吸收量對時間作相關回歸分析得出的斜率，A為腸段吸收表面積(cm2)

表觀滲透系數用公式：

Papp=ΔQ/Δt×A×C0

吸收速率常數[Ka,μg/(min·cm)]的計算公式：

Ka=L/A

3 結果

3.1 標準曲線的繪制

取“2.2”項下方法配置的對照品溶液，按照“2.4”項下色譜條件進行測定。記錄色譜圖，以峰面積為橫坐標，以濃度為縱坐標，進行線性回歸，標準曲線回歸方程分別為：小檗堿：y=0.000 8x+0.000 4，R2=0.998 9；藥根堿：y=0.000 6x+0.000 1，R2=0.999；巴馬汀：y=0.000 9x-0.001 4，R2=0.994 5。小檗堿、巴馬汀、藥根堿標準品的色譜圖見圖1。

圖1 小檗堿、巴馬汀、藥根堿標準品色譜圖

3.2 精密度考察

將小檗堿、藥根堿、巴馬汀標準品溶液，連續進樣5次，測定日內精密度，再分別將對照品第1、3、5天內各測定1次，測定日間精密度。日內精密度分別為：

1.48%、1.65%、1.37%，日間精密度分別為：1.23%、1.39%、0.42%。

3.3 穩定性考察

精密吸取各劑量中的同一小鼠的同一段腸囊中的供試品溶液20 μL，分別于0～24 h內測定小檗堿、藥根堿、巴馬汀標準品峰面積，得RSD值分別為：1.82%、0.81%、0.44%。說明小檗堿、藥根堿、巴馬汀標準品穩定，符合實驗要求。

3.4 腸內樣品含量測定結果

取供試品溶液20微升進高效液相，按照“2.4”項下條件進行測定，樣品的色譜圖見圖2。

圖2 樣品色譜圖

將得到的峰面積值帶入標準曲線中，計算出其中的各組分的濃度，用2.6項下公式計算出濃度、平均吸收藥量ΔQ和Papp值的±s，以時間為橫坐標,以累計吸收量為縱坐標,得到吸收速率常數K，結果見表1。從表1可以看出，隨著時間的增加，小檗堿、巴馬汀、藥根堿的平均吸收量均Q值逐漸增加，隨著濃度的增加,高、中、低3個劑量組的吸收量增加幅度明顯，接近成倍增加，符合濃度增加1倍吸收增加量增加近1倍的吸收特性。3種生物堿的Papp值隨濃度的增加呈逐漸增大的趨勢。在同一腸段中，3種生物堿的Papp值隨時間的增加在20～40 min時有所降低，在40 min后趨于穩定。

表1 3種生物堿不同時間、不同濃度在腸囊內的ΔQ值與Papp值及吸收速率常數K值

以時間(min)為橫坐標、以累計吸收量Q(μg)為縱坐標得到濃度對吸收量的曲線所得K值，見圖3。圖3-1為小檗堿3個濃度對吸收量的曲線所得K值，分別為0.97、0.98、0.98。圖3-2為巴馬汀3個濃度對吸收量的曲線所得K值，分別為 0.98、0.95、0.98。圖3-3為藥根堿3個濃度對吸收量的曲線所得K值，分別為0.99、0.96、0.94。由所得K值均大于0.9可以看出三種生物堿的腸吸收均為零級吸收，隨時間與濃度的增加吸收量值逐漸增大，具有一定的線性關系，符合被動轉運吸收方式[7]。

圖3 3種生物堿不同濃度對吸收量的曲線所得K值

4 討論

外翻腸囊模型是一種極為簡單而又快速檢查藥物吸收以及確認腸道代謝的方法，廣泛應用于小腸吸收的研究。本實驗采用外翻腸囊法結合高效液相色譜法，檢測左金丸浸膏中的小檗堿、藥根堿、巴馬汀含量，實驗得到的吸收結果與體內藥物吸收的真實水平接近。并且其吸收成分的種類少于湯中的成分，因此與藥物的譜效相關分析相比較，外翻腸囊法所注重的是藥物與機體的相互影響，并且此方法的結果分析難度較低。左金丸的主要化學成分在外翻腸囊中主要的吸收過程為累積吸收，在此過程中極少受其他因素如分布、代謝及排泄等過程的影響，并且可以避免對檢測條件要求高的弊端，因此利用外翻腸囊法進行研究可以為譜效相關的研究提供依據。

本次實驗采用ICR小鼠，對左金丸中三種生物堿成分進行了腸吸收研究，通過外翻腸囊法研究發現,左金丸中3種生物堿成分在小鼠腸囊內的吸收K值均大于0.9,說明3種成分均為零級吸收。研究發現小檗堿、巴馬汀、藥根堿三種生物堿在同一時間段內平均吸收量ΔQ隨濃度的增大而增加，同時Papp值也隨濃度的增加而呈增加趨勢。在同一濃度下，隨著孵育時間的延長單位面積的平均吸收量ΔQ增加，表觀分布系數Papp值會隨時間的延長而減小最后趨于穩定。Papp值的減少可能是腸上留有的活性蛋白，其對于藥物的擴散具有促進或抑制作用。此外還可能與腸囊內外溶液濃度差逐漸縮小，腸囊內濃度逐漸飽和有關。不同劑量，面積大小幾乎相等的腸段高劑量實驗組的累積吸收藥量明顯高于中、低劑量實驗組，符合前期的設想：左金丸中小檗堿在腸內的吸收過程主要與腸囊的面積、藥液濃度以及吸收時間有關。

已知某些藥物在小腸中具有優先吸收位點，了解此類口服藥物的主要吸收部位對于開發理想的藥物產品以及實現臨床有效和可靠的藥物治療非常重要[8-12]。因此，研究藥物在體內的吸收過程具有重要的意義，同時，此項研究還可以為藥物體內分布，代謝等研究提供一定的依據。