川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的制備及體內外特性評價

李維 陳梁 尹丹 楊昊 周佳儀 宋雨 張艷 鄒亮

摘 要 目的：制備川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠，考察其體內外特性。方法：采用硫酸銨梯度法制備川芎嗪脂質體，以正交試驗優化制備工藝，并以泊洛沙姆P407為凝膠基質進一步制成溫敏凝膠。采用無膜溶出模型對該凝膠的溶蝕性和體外釋藥特性進行研究;采用改良Franz擴散池考察其角膜透過性，并進一步測定角膜水化值;采用MTT法評價該凝膠對人角膜上皮細胞HCE-T增殖的影響;采用蘇木素-伊紅染色法和Draize眼部刺激評分考察該凝膠對家兔角膜的刺激性，并觀察其眼部組織學變化。結果：川芎嗪脂質體的最優制備工藝為藥脂比1 ∶ 10（m/m）、硫酸銨溶液濃度0.2 mol/L、磷脂與膽固醇質量比4 ∶ 1、孵育溫度45 ℃;再以23%質量分數的泊洛沙姆P407作為凝膠基質制得川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠。該凝膠具有良好的膠凝溫度;其溶蝕和體外釋藥均呈零級動力學特征，且體外釋藥主要與溶蝕相關（R2=0.993 4）。該凝膠6 h內累計透過量為43.3%;角膜水化值為72.98%。低、中質量濃度（1、5 mg/L）的川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠對HCE-T細胞無明顯增殖毒性，但其在高質量濃度（10 mg/L）時顯示出一定的細胞毒性。該凝膠對家兔角膜的Draize眼部刺激平均評分屬于無刺激范圍，且家兔角膜組織學未見異常變化。結論：所制備的川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠具有適宜的膠凝溫度，對角膜滲透性好、刺激性小。

關鍵詞 川芎嗪眼用脂質體;溫敏凝膠;制備工藝;體外釋藥特性;人角膜上皮細胞HCE-T;眼部刺激性;角膜組織學

中圖分類號 R943;R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）03-0320-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.03.12

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To prepare Liguatrazine ophthalmic liposome thermosensitive gel， and to investigate its in vivo and in vitro characteristics. METHODS： The ammonium sulfate gradient method was used to prepare Liguatrazine liposomes. The preparation technology was optimized by using orthogonal test. Using poloxamer P407 as gel matrix， Liguatrazine liposomes were prepared into thermosensitive gel. A membraneless model was used to study the dissolution and in vitro drug release of the gel. The modified Franz diffusion cell was used to investigate corneal permeability and further determine corneal hydration value. The effects of the gel on the proliferation of human corneal epithelial cell HCE-T. HE staining and Draize test were used to investigate the stimulatory effects of the gel on corneal cells of the rabbit， and the histological changes of the eyes were observed. RESULTS： The optimal preparation technology of Liguatrazine liposome was drug-lipid ratio of 1 ∶ 10（m/m）， the ammonium sulfate concentration of 0.2 mol/L， phospholipid-cholesterol ratio of 4 ∶ 1 （m/m）， incubation temperature of 45 ℃. Then ligustrazine ophthalmic liposome thermosensitive gel was prepared with 23% poloxamer P407 as gel matrix. The gel had good gelatinization temperature. The in vitro drug release and dissolution showed zero-order kinetic characteristics， and in vitro drug release of the gel was mainly related to dissolution （R2=0.993 4）. The cumulative transcorneal permeability of the gel was 43.3% within 6 hours and corneal hydration value was 72.98%. Low and medium concentrations （1， 5 mg/L） of Ligustrazine ophthalmic liposome thermosensitive gel had no obvious proliferation toxicity to HCE-T cells， but it showed cytotoxicity at high concentration （10 mg/L）. The mean Draize eye irritation score of the gel on rabbit cornea was within non-stimulation， and there was no abnormal change in rabbit corneal histology. CONCLUSIONS： Prepared Ligustrazine ophthalmic liposome thermosensitive gel has a suitable phase transition temperature， good corneal permeability， and low corneal irritation.

KEYWORDS? ?Ligustrazine ophthalmic liposome; Thermosensitive gel; Preparation technology;? in vitro drug release; Human corneal epithelial cell HCE-T; Eye irritation; Corneal histology

川芎嗪（Ligustrazine）即四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TMP），是中藥川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的主要有效成分。傳統醫學認為，川芎味辛，性溫，歸肝、膽、心經，具有活血祛瘀、行氣開郁的功效;其藥效主要包括活血與行氣兩方面，其中活血功效最為關鍵，符合中醫眼疾治則，而其有效成分制劑川芎嗪注射液可用于臨床治療視網膜相關疾病[1]。現代藥理研究表明，川芎嗪具有抗炎、抗氧化、增強心肌收縮力、減少腦損傷、保護冠狀動脈、抗血栓等多種藥理活性[2-7]。近年來，研究人員發現川芎嗪具有抗血管內皮生長因子（VEGF）、抑制眼部新生血管等作用[8-9]，可用于眼部新生血管疾病的防治。然而，眼是一個相對獨立的器官，其解剖結構含有無血成分和中樞神經系統成分等，其特殊的生理屏障大大限制了藥物的有效傳遞[10]，因此亟需尋找一種新型眼用給藥系統來提高眼部遞藥效率和生物利用度。

有研究者制備了川芎嗪脂質體并發現其可持續釋放藥物到達角膜或結膜，但由于角膜屏障的存在，同時受淚液沖刷的影響，大多數藥物會隨著眼淚排出，余下藥物則部分進入鼻淚管、部分經過結膜入血進入體循環[11]。因此，單獨使用脂質體遞藥存在眼部滯留時間短、生物利用度低等問題，只能通過增加給藥次數和提高藥物濃度來達到治療效果[12]，患者使用不便，易產生全身毒副作用[13]。脂質體溫敏凝膠劑（Liposome thermosensitive gel）是一種新型復合劑型，是將脂質體分散在凝膠基質中形成的新型復合凝膠，常溫下為液態，若給藥部位溫度高于膠凝溫度，可立即轉為非化學交聯的半固定凝膠，這樣不僅能保持脂質體自身固有特性，還能延長脂質體在角膜上的滯留時間，從而延緩藥物釋放、增強藥物吸收[14]。泊洛沙姆P407是一種具有良好的生物相容性和緩釋性、局部惰性、低毒性并易與其它劑型配伍的溫度敏感材料，常在外用溶液中作為凝膠基質使用[15]。筆者以泊洛沙姆P407作為凝膠基質制備川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠，以期提高藥物在眼部的傳遞效率，延長藥物作用時間，減少給藥次數，改善患者順應性，提高藥物的生物利用度。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器有：1100型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）、ZEN3600型納米粒度儀（英國Malvern公司）、改良Franz擴散池（上海鍇凱科技貿易有限公司）、CPA225D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）、KMH1型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、HH-4型數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州匯成科工貿有限公司）、RE-2000B型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、Ymnl-1000Y型超聲波細胞粉碎機（南京以馬內利儀器設備有限公司）、UPH-Ⅱ-10T型超純水制造系統（四川優普超純科技有限公司）、Tecnai G2 F20 S型透射電鏡（TEM，美國FEI公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究使用的主要藥品與試劑有：川芎嗪對照品[薩恩化學技術（上海）有限公司，批號EH230112，純度≥99%]，卵磷脂[分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號D1918047]，膽固醇、泊洛沙姆P407（分析純，大連美侖生物技術有限公司，批號分別為F0119A、J0102A），? L-氧化型谷胱甘肽、二水氯化鈣（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為Q14D9J77577、Z01M10Y81919），磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 6.8）、胰蛋白酶、DMEM高糖培養基[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號分別為8119056、8119244、8119181]，胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號分別為19030604、J180025），MTT試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號042319190619），2%磷鎢酸負染色液（北京索萊寶科技有限公司），蘇木素-伊紅（HE）染色液（北京世濟合力生物科技有限公司），二甲基亞砜（武漢博士德生物工程有限公司），硫酸銨、氯化鈉、氯化鎂、三氯甲烷、葡萄糖、碳酸氫鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、生理鹽水、二甲苯、無水乙醇等（成都市科隆化學品有限公司），超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為新西蘭大白兔，雄性，體質量2.0～2.5 kg，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號為SCXK（川）2020-030。

1.4 細胞

本研究所用細胞為人角膜上皮細胞HCE-T，由北京北納創聯生物技術研究院提供。

2 方法與結果

2.1 川芎嗪的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（90 ∶ 10，V/V），檢測波長為280 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2.1.2 含量測定 精密稱取川芎嗪對照品10.23 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲（頻率40 kHz，功率100 W）溶解并定容，得川芎嗪對照品貯備液。分別精密量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL對照品貯備液置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列對照品溶液;搖勻，各取1 mL，以0.22 ?m微孔濾膜濾過后取續濾液10 ?L，按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（Y）對川芎嗪質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y=13 532X-10 531（R2=0.999 5）。結果表明，川芎嗪的質量濃度在5.08～30.48 ?g/mL范圍內與其峰面積線性關系良好。

分別取川芎嗪對照品溶液、川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠、人工淚液（空白）各1 mL，以0.22 ?m微孔濾膜濾過后取續濾液10 ?L，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果可得，川芎嗪的保留時間約為3.8 min，理論板數按川芎嗪峰計算應不低于3 000，空白無干擾，詳見圖1。

2.2 川芎嗪脂質體的制備

根據川芎嗪的理化性質，采用硫酸銨梯度法制備川芎嗪脂質體[16-17]。精密稱取處方量的卵磷脂、膽固醇置于250 mL茄形瓶中，加入約10 mL三氯甲烷溶解，于37 ℃水浴減壓旋蒸形成均勻薄膜，再加入8 mL 0.2 mol/L的硫酸銨溶液，水化脫膜形成多室脂質體后置于冰浴（0±0.5） ℃中超聲2 min（功率400 W，頻率40 kHz，每超聲3 s后暫停3 s），然后裝入透析袋于生理鹽水中透析24 h，每隔4 h更換生理鹽水，得到空白脂質體。在空白脂質體中按一定藥脂比[即川芎嗪與脂類（磷脂和膽固醇）的質量比]加入川芎嗪對照品溶液，于45 ℃下孵育20 min，得到川芎嗪脂質體。

2.3 川芎嗪脂質體制備工藝考察

2.3.1 單因素試驗 以包封率為指標，按“2.2”項下方法考察藥脂比（1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20，m/m）、孵育溫度（25、35、45、55 ℃）、孵育時間（10、20、30、40 min）、硫酸銨溶液濃度（0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L）、卵磷脂與膽固醇質量比（1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1）、磷脂質量分數（0.8%、1.0%、1.2%、1.5%）、超聲功率（300、400、500、600 W）和超聲時間（2、4、6、8 min）等因素對川芎嗪脂質體包封率的影響[包封率（%）=W包封/W總量×100%，式中W包封為被脂質體包封的藥物量，W總量為實際加入的總藥物量]。結果，在藥脂比為1 ∶ 15（m/m）、孵育溫度為45 ℃、孵育時間為20 min、硫酸銨溶液濃度為0.3 mol/L、卵磷脂與膽固醇質量比為4 ∶ 1、磷脂質量分數為1.2%、超聲功率為400 W、超聲時間為2 min時，所制脂質體包封率較高。

2.3.2 正交試驗 根據單因素試驗結果，選擇對包封率影響較大的因素[藥脂比（A）、硫酸銨濃度（B）、卵磷脂與膽固醇質量比（C）、孵育溫度（D）]設計 L9（34）正交試驗。川芎嗪脂質體制備工藝的正交試驗因素與水平見表1;正交試驗設計及結果見表2;方差分析結果見表3。

由表1、表2可知，各因素對川芎嗪包封率影響的大小順序為：B>C>A>D，即硫酸銨濃度>卵磷脂與膽固醇質量比>藥脂比>孵育溫度。由表3可知，4種因素對川芎嗪包封率均無顯著性影響（P>0.05）。結合表1～表3結果，綜合考慮得最優工藝為A1B2C3D3，即藥脂比為1 ∶ 10、硫酸銨濃度為0.2 mol/L、磷脂與膽固醇質量比為4 ∶ 1、孵育溫度為45 ℃。

2.3.3 驗證試驗 依據“2.3.2”項下確定的最優工藝，按“2.2”項下方法平行制備川芎嗪脂質體3批，測定其包封率。結果，3批樣品的平均包封率為（15.82±0.06）%（n=3），表明優化后的工藝穩定、可行。

2.4 川芎嗪脂質體的表征及評價

2.4.1 粒徑測定 取川芎嗪脂質體適量，加水1 mL稀釋，采用納米粒度儀測量其粒徑，重復3次。結果，川芎嗪脂質體的平均粒徑為（185.6±5.0） nm（n=3），多分散度指數（PDI）為0.22±0.03（n=3），詳見圖2A。根據文獻報道，粒徑小于200 nm的脂質體有利于眼部藥物遞送[18]，因此本研究制備的川芎嗪脂質體可進一步用于非侵入性眼部給藥。

2.4.2 粒子形態觀察 取川芎嗪脂質體適量，加適量水稀釋，沾取少量置于銅網上，以濾紙吸走多余水分，2%磷鎢酸負染色液負染2～3 min，自然干燥后置于TEM下觀察、拍照。結果，鏡下可見川芎嗪脂質體粒子較圓整、呈均勻球形、大小較平均，該結果與粒徑測定結果相符合，詳見圖2B。

2.4.3 pH值測定 取川芎嗪脂質體5 mL，加入5 mL新煮沸并冷卻至室溫的水，攪拌均勻，在室溫下測定其pH值，平行測定3批。結果，3批樣品的平均pH值為7.10±0.12（n=3），符合眼用制劑pH值要求（pH 6.0～8.0）[19]。

2.5 川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的制備

取5 g泊洛沙姆P407加至10 mL水中，于4 ℃冷藏，使基質充分溶脹、溶解均勻，得到凝膠基質溶液。在冰水浴中向川芎嗪脂質體加入適量凝膠基質溶液，使得泊洛沙姆P407占溫敏凝膠的質量分數為23%，攪拌混合均勻，即得川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠，備用。

2.6 川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠膠凝溫度的測定

2.6.1 人工淚液的配制 取氯化鈉6.78 g、碳酸氫鈉2.18 g、二水氯化鈣0.084 g、氯化鉀1.38 g，置于同一? ? 1 000 mL量瓶中，以水溶解并定容至1 000 mL，于4 ℃冷藏，備用。

2.6.2 測定方法及結果 采用傾斜試管法測定膠凝溫度[20]。取2.0 mL川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠，置于西林瓶中，插入溫度計至液面以下1/3高度處。將西林瓶置于恒溫水浴鍋中，以1 ℃/min緩慢升溫，每隔1 min將西林瓶取出，傾斜90°，觀察內容物狀態，當瓶內液體不流動時的溫度即為膠凝溫度。平行測定5次，取平均值。另取川芎嗪脂質體溫敏凝膠適量，滴加至人工淚液（已于35 ℃恒溫30 min）中，觀察膠凝狀態，并考察不同質量分數的泊洛沙姆P407對該凝膠膠凝狀態的影響，結果見表4。由表4可知，當川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠中泊洛沙姆P407的質量達到該凝膠總質量的23%時，在24.30 ℃可形成凝膠;將其直接滴入35 ℃恒溫人工淚液中，能夠較好地形成凝膠，符合實際給藥要求。

2.7 川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的溶蝕性和體外釋藥特性考察

采用無膜溶出模型考察川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的溶蝕性和體外釋藥特性[21]。將5 g川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠置于已稱定質量的西林瓶中，記錄初始質量，然后置于（35.0±0.5） ℃恒溫水浴鍋中加熱至其完全膠凝。向該西林瓶中加入同溫度的人工淚液2 mL，在一定頻率（10 kHz）下恒溫振蕩20 min后立即取出，倒出人工淚液，將瓶拭干后迅速稱質量。重新將西林瓶放入恒溫水浴鍋中平衡溫度，補充同溫度的人工淚液至初始質量，繼續振蕩20 min。如此反復操作，直至剩余凝膠質量不足起始量的10%為止。平行測定3次。相鄰時間點的瓶內剩余凝膠質量差即為此期間凝膠溶蝕量，凝膠溶蝕率=凝膠溶蝕量/初始質量。以凝膠溶蝕率（Y）為縱坐標、時間（X）為橫坐標繪制凝膠溶蝕曲線，詳見圖3。由圖3可知，川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的溶蝕呈零級動力學特征，計算得回歸方程為Y=0.280 5X+2.100 8（R2=0.998 6）。

分別吸取上述凝膠溶蝕曲線每個時間點對應的人工淚液1 mL至10 mL量瓶中，以甲醇超聲（頻率40 kHz，功率100 W）破乳并定容，經0.22 μm微孔濾膜濾過，按“2.1.1”項下色譜條件測定人工淚液中川芎嗪的含量，平行測定3次。以某時間點累計釋放藥物總量除以加入藥物總量可得該時間點的體外累計釋放率，再以體外累計釋放率（Y）為縱坐標、時間（X）為橫坐標繪制體外釋藥曲線，詳見圖4。由圖4可知，川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的體外釋藥亦呈零級動力學特征，計算得回歸方程為Y=0.256 8X+7.630 8（R2=0.987 6）。

以凝膠溶蝕率（Y）對體外累計釋放率（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y=0.917 7X+5.605 2（R2=0.993 4），說明兩者相關性良好，該凝膠的體外釋藥主要與其溶蝕相關。

2.8 不同川芎嗪制劑的離體角膜透過性實驗

2.8.1 谷胱甘肽-碳酸氫鈉林格溶液（GBR溶液）的配制 A溶液：稱取氯化鈉12.49 g、氯化鉀0.716 g、磷酸二氫鉀0.206 g、碳酸氫鈉4.908 g，加水溶解并定容至1 000 mL;B溶液：稱取氯化鈣0.23 g、氯化鎂 0.318 g、葡萄糖 1.80 g、L-氧化型谷胱甘肽 0.184 g，加水溶解并定容至? ?1 000 mL;A、B溶液均于4 ℃貯存，臨用時按1 ∶ 1（V/V）比例配制成GBR溶液，現配現用[22]。

2.8.2 離體角膜的準備 耳緣靜脈注射空氣處死家兔后20 min內開始實驗：摘除眼球，沖去表面附著的血塊，置于35 ℃的GBR溶液（于水浴鍋中放置30 min使溫度維持在35 ℃）中以保存離體角膜活性;清除鞏膜表面的動眼肌和瞼結膜附屬組織，由視神經縱向前剖開眼球，至距角膜邊緣約2 mm的鞏膜處橫切，分離角膜，除去晶狀體、玻璃體等眼球后部組織，用眼科鑷子輕輕剝離虹膜、睫狀體，得到帶有2 mm鞏膜環的角膜，用GBR溶液淋洗3次，備用。

2.8.3 離體角膜透過性實驗 取“2.8.2”項下準備好的離體角膜，固定于改良Franz擴散池的供給池和接受池之間，將角膜上皮層面向供給池;接受池內裝滿人工淚液（內含一個攪拌子）。在供給池內先加入恒溫35 ℃的人工淚液50 μL以模擬眼部濕潤環境，再分別加入pH 6.8的川芎嗪水溶液（取川芎嗪對照品適量加入含0.1%二甲亞砜的PBS溶液，制得1.00 mg/mL的川芎嗪水溶液）、川芎嗪脂質體、川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠各0.5 mL，將整個裝置置于（35±1） ℃的恒溫磁力攪拌器上攪拌并開始計時，分別于1、2、3、4、5、6 h時從接受池取樣0.65 mL（同時補加等體積同溫度的人工淚液）。從接受池取出的樣品經甲醇（取樣液與甲醇體積比為1 ∶ 1）破乳并經0.22 μm微孔濾膜濾過后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，平行3次，記錄峰面積，代入“2.1.2”項下回歸方程計算待測樣品中川芎嗪的質量濃度，再分別按下述公式計算各樣品的累計透過量（Qn）：

式中，V0為接受池中溶液體積，cn 為t時間下測定的藥物濃度，V為取樣體積，ci 為第i個（i=n-1）時間點測定的藥物濃度。以累計透過量對時間作圖，詳見圖5。由圖5可知，川芎嗪水溶液在前3 h透過離體角膜較快，3 h后透過速率降低，6 h內累計透過量為56.8%;川芎嗪脂質體總體上以恒定的速率（即曲線斜率）透過離體角膜;川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的透過速率較脂質體和水溶液更慢，6 h內累計透過量為43.3%，且實驗結束時供給池內仍有約1/2凝膠尚未溶蝕。

2.8.4 角膜水化值考察 取“2.8.3”項下川芎嗪水溶液組、川芎嗪脂質體組和川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠組離體角膜，剪去未暴露于GBR溶液的角膜區域。稱取暴露于GBR溶液的角膜區域質量，記為Wb;將其于65 ℃干燥12 h后再次稱質量，記為Wa，計算角膜水化值[角膜水化值=（Wb-Wa）/Wb]，結果見表5。

角膜水化值是體外評價物質對角膜組織刺激性的重要指標，若大于83%即可判定角膜受到一定程度的損傷[23]。由表5可知，川芎嗪脂質體和川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的角膜水化值都小于83%，對角膜刺激性小;但川芎嗪水溶液的角膜水化值大于83%，表明其對角膜的刺激性大，究其原因，可能是因為未包封的川芎嗪原型藥物直接與角膜上皮細胞接觸，破壞了角膜上皮和內皮細胞的緊密連接，進而使得角膜的水通透性增加。

2.9 不同川芎嗪制劑對HCE-T細胞增殖的影響

將HCE-T細胞采用DMEM高糖培養基于37 ℃、5% CO2條件下培養。當HCE-T細胞培養到70%～80%融合程度后用PBS清洗2次，加入1 mL胰蛋白酶消化2 min。當細胞變圓并開始脫落時加入DMEM高糖培養基5 mL終止消化且吹打均勻，采用15 mL的離心管收集混懸的細胞液，以1 000 r/min離心 5 min，棄去上清液，加入DMEM高糖培養基2 mL，輕輕吹打混勻，制得細胞懸液。將細胞懸液以5×103個/孔接種于96孔板中，分為給藥組（不同濃度藥物+細胞）、空白組（含細胞不含藥物）和調零組（只含培養基），放入培養箱中培養16 h使細胞貼壁后棄去培養液，再分別加入低、中、高質量濃度的藥物溶液[川芎嗪脂質體和川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠，均分別為1、5、10 mg/L（以川芎嗪計）]，繼續培養24 h。棄去培養液，加入含MTT的PBS溶液后放置4 h，棄去含MTT的培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩20 min后采用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度（A），按下述公式計算細胞存活率：細胞存活率=（A給藥-? ?A調零）/（A空白-A調零） 。式中，A給藥、A調零、A空白分別表示給藥組、調零組、空白組的吸光度。試驗重復5次。24 h內不同質量濃度的川芎嗪制劑對HCE-T細胞存活率的影響見圖6。

由圖6可知，低、中、高質量濃度（1、5、10 mg/L）的川芎嗪脂質體和低、中質量濃度（1、5 mg/L）的川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠對HCE-T細胞無明顯的增殖毒性（細胞存活率>85%）;高質量濃度（10 mg/L）的川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠對HCE-T細胞顯示出了一定的毒性，可能是由于高質量濃度脂質體溫敏凝膠基質材料較多，改變了培養基的狀態，影響了細胞的正常生長。

2.10 川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的眼部刺激性考察

取家兔6只，將其右眼作為實驗眼，給予適量川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠;左眼作為對照眼，給予等量生理鹽水。分別記錄單次給藥后2、6、12、24、72、96、120、144、168 h時兔眼的角膜、結膜、虹膜及其他前節組織情況，按照Draize眼刺激實驗評分標準[24-25]進行眼部刺激性考察，詳見表6、表7。結果顯示，實驗眼的結膜多數在第1次給藥后產生少量分泌物，平均評分為（0.83±0.75）分，其余時間點兩組兔眼前節組織評分均為0分，均在0～3分的無刺激性范圍內。

2.11 川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠對兔眼角膜組織學的影響

取“2.10”項下實驗家兔，于最后一次實驗眼的眼表滴入川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠后12 h分離出角膜組織，以10%中性福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、二甲苯清洗、石蠟固定、切片（厚度為3 μm），再以HE染色，用顯微鏡觀察兔眼角膜及視網膜組織學改變;取另一只滴入生理鹽水的對照眼同法操作，作為對照，結果見圖7。由圖7可知，滴入川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的兔眼角膜上皮細胞分層良好，基質層纖維排列規則，均未見炎性細胞;角膜上皮、前界層、角膜基質、后界層和角膜內皮細胞結構完整、排列整齊，各層細胞分界清晰，與對照眼比較無明顯差異，表明川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠對角膜無刺激性。

3 討論

泊洛沙姆P407為聚氧乙烯-聚氧丙烯醚-聚氧乙烯三嵌段共聚物，在低溫或低濃度條件下為液體，升溫至膠束溫度且達到臨界膠束濃度時可發生膠凝[26]。由于其毒性低、刺激性小、緩/控釋作用突出，故成為了目前較為常用的眼、鼻以及直腸給藥載體[27-29]。而脂質體親和性好、滲透性優、安全無毒，已廣泛地應用在制劑領域。本研究將兩種載體相結合，將脂質體均勻地分布在泊洛沙姆P407中，能防止其聚集、融合，可進一步地提高其穩定性。普通滴眼液與脂質體入眼后，很快地被淚液稀釋沖蝕，在角膜滯留時間短，以致用于眼部病患處的藥物量常常不足。而脂質體溫敏凝膠以溶液狀態給藥，能迅速形成凝膠黏附于角膜，可緩慢地透過角膜屏障遞送藥物，避免了持續大劑量給藥引起的多種不良反應[30-31]。

本研究首先考察了川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的制備工藝，再從其體外釋藥特性和對角膜的刺激性兩方面對制劑質量進行了評價。結果顯示，所制備的川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠給藥方便、膠凝溫度適宜，能在眼部濕潤條件下產生相變從而黏附在角膜上持續給藥。通過凝膠溶蝕和體外釋藥實驗可知，川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的釋放主要與其溶蝕相關。在離體角膜實驗中，川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的6 h累計透過量為43.3%，展現了較好的生物相容性。川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠相較于川芎嗪脂質體顯示了緩釋的優勢，其藥物的釋放很大程度上依賴于凝膠的溶蝕。在6 h角膜透過實驗中，能明顯看見供給池中還有約1/2的凝膠未被溶蝕，且角膜水化值小于83%，可見川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠緩釋性好。通過離體角膜水化值測定、體外細胞增殖毒性實驗、家兔角膜刺激性考察和角膜組織學觀察，進一步證實了川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠安全性較高、刺激性較小，體現了脂質體凝膠作為一種生物利用度高且安全刺激性小的新型局部給藥系統，對眼部疾病的防治具有現實意義。

綜上所述，本研究所制備的川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠具有適宜的膠凝溫度，對角膜滲透性好、刺激性小。本研究可為川芎嗪眼部制劑的進一步研發提供依據，但也存在不足之處：所制備的川芎嗪脂質體的包封率有待進一步提高;由于體外藥物釋放特性與體內藥物釋放特性具有一定差異，而本研究只考察了該凝膠的體外藥物釋放特性，因此有關川芎嗪脂質體和川芎嗪眼用脂質體溫敏凝膠的跨膜轉運機制及藥效學作用有待進一步研究。

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（收稿日期：2020-08-11 修回日期：2020-12-25）

（編輯：胡曉霖）