酶制劑對綠狐尾藻、稻秸粉與玉米粉混合青貯品質的影響

吳康樂，曹 欣，謝 展，肖潤林，張志飛

（1.湖南農業大學農學院, 湖南 長沙 410128；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所, 湖南 長沙 410125）

綠狐尾藻（Myriophyllum elatinoides)是小二仙草科狐尾藻屬多年生沉水或浮水草本植物。綠狐尾藻適應性強、生物產量大，年產鮮草600～900 t·hm-2，是畜禽污水治理中較好的生物資源[1]。綠狐尾藻莖葉脆嫩，營養價值高[2]，但綠狐尾藻飼料化利用受到含水量較高（90%左右)的制約。相較于曬（烘)制干草，綠狐尾藻與稻（Oryza sativa)秸、精料等干物質含量高的輔料混合青貯加工成青貯飼料更加適合。采用干物質含量高的玉米（Zea mays)粉或秸稈等與高水分新料混合青貯，可平衡青貯發酵時乳酸菌對水分的需求。玉米粉富含碳水化合物，常被用作與苜蓿（Medicago sativa)[3]、麻葉蕁麻（Urtica cannabina)[4]等青綠飼草或馬鈴薯（Solanum tuberosum)淀粉渣[5]等生物資源的輔料進行混合青貯，可達到較好的發酵效果。水稻秸稈在我國產量大，易收集，價格低，在高水分青綠飼草混合青貯中添加可有效降低含水量[6]，但水稻秸稈的纖維含量較高，混合青貯會增加纖維含量。而纖維素酶可分解纖維素，木聚糖酶可降解半纖維素中的阿拉伯木聚糖，二者均能將植物細胞壁成分降解為可溶性糖，為乳酸菌發酵提供碳源，有效改善發酵品質，是常用的青貯促進劑[7-8]。

前期預備試驗發現，精細粉碎后的稻秸粉較粉碎的稻秸吸水性更好，且更利于與綠狐尾藻均勻混合；質量比70% ∶ 15% ∶ 15%的綠狐尾藻、稻秸粉和玉米粉混合后可基本滿足適宜青貯的含水量（65% ±5%)要求。本研究以此混合比例的青貯原料為研究對象，分別添加纖維素酶、木聚糖酶以及復合纖維素酶，旨在探究3 種酶制劑對綠狐尾藻混合青貯的營養品質、發酵品質及有氧穩定性的影響，篩選適宜青貯添加劑，為綠狐尾藻飼料化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于中國科學院農業環境監測站（28°55′36″ N，113°34′65″ E)三級綠狐尾藻表面流人工濕地的第三級濕地人工采集自然株高50 cm 左右的綠狐尾藻，粉碎至2～3 cm；稻秸粉和玉米粉為精細粉碎至1 mm 粉末。混合青貯原料為新鮮綠狐尾藻 + 稻秸粉 + 玉米粉，質量比為70% ∶ 15% ∶ 15%。青貯原料的化學成分如表1 所列。

表1 青貯原料化學成分Table 1 Chemical composition of ensilage materials

纖維素酶（50 000 U·g-1)和木聚糖酶（100 000 U·g-1)來源于羅恩試劑有限公司，復合纖維素酶（纖維素酶20 000 U·g-1+ 木聚糖酶15 000 U·g-1)來源于廣州溢多利有限公司。

1.2 試驗設計

本試驗共4 個處理，處理1 （C1)為添加纖維素酶0.5 g·kg-1，處理2 （C2)為添加木聚糖酶0.25 g·kg-1，處理3 （C3)為添加復合纖維素酶0.71 g·kg-1，以上3 種酶分別溶解至10 mL 水中備用，處理4 為對照組（CK)添加10 mL 等量水。以上添加比例均以混合原料鮮重為基礎計算。

首先在稻秸粉上分別均勻噴灑各處理組的酶制劑，對照噴灑等量水，再與一定比例的綠狐尾藻、玉米粉均勻混合。用聚乙烯袋（長40 cm，寬28 cm，厚度0.02 mm)抽真空保存，每袋500 g 左右，每處理5 次重復。避光常溫保存30 d 后開包測定各項指標。

1.3 測定指標及測定方法

開包后依據德國農業協會（DLG)評分法[9]對混合青貯飼料的嗅覺、結構、色澤3 項指標進行評分，最后計算總分評價等級。

隨后每處理隨機取20 g 青貯鮮料，加180 mL去離子水，榨汁機（九陽JYL-C012 型多功能攪拌機)粉碎，4 層紗布過濾后得到青貯飼料浸提液，每處理3 次重復。浸提液用于測定pH、氨態氮（NH3-N)[10]、乳酸及揮發性脂肪酸含量，3 次重復。乳酸（lactic acid，LA)含量使用高效液相色譜儀（Agilent 1 260)測定（色譜柱：AcclaimTMOrganic acid （4.00 mm × 150 mm，5 μm)；進樣體積：5 μL；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30 ℃；流動相：50 mmol·L-1磷酸二氫鈉溶液，運行時間：10 min；檢測波長210 nm)；乙酸（acetic acid，AA)、丙酸（propionic acid，PA)和丁 酸（butyric acid，BA)含量使用氣相色譜儀（Agilent 7 890A)測定（色譜 柱：DB-FFAP （30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；流 速：0.8 mL·min-1；進樣量：1 μL；分流比：50 ∶ 1；程序升溫條件：60 ℃，保持2 min，以20 ℃升至220 ℃，保持3.5 min；檢測器：氫火焰離子化檢測器，溫度：250 ℃)。

另取150 g 青貯飼料，105 ℃殺青15 min 后，65 ℃烘干至恒重，用于測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF)、粗蛋白質（crude protein，CP)、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC)等指標[11]，3 次重復。

依據日本草地畜產協會制定的青貯飼料發酵品質V-Score 評分標準[12]，計算V-Score 值，80 分以上良好，60～80 分尚可，60 分以下不良。

1.4 青貯飼料有氧穩定性分析

開包后取200 g 青貯料于敞口發芽盒（12 cm ×12 cm)中室溫下存放，表面蓋上濕紗布，防止交叉污染和減少水分損失。發芽盒中心插入電子溫度計至青貯料中2～3 cm，每隔2 h 自動記錄一次溫度，飼料核心溫度比外界溫度高出2 ℃時結束試驗[13]。3 次重復。以蒸餾水為空白對照。

1.5 數據分析

采用DPS 7.05 對不同處理組青貯飼料的部分發酵指標和營養指標等進行單因素LSD 多重比較。

2 結果與分析

2.1 混合青貯飼料的感官評價

從氣味、結構與色澤等方面評價各酶制劑處理組的感官質量（表2)，結果發現，4 個處理組評價均達到優等，總分最高的為C2和C3（19 分)，有芳香果味或明顯的面包香味；C1和CK 為16 分，有微弱的丁酸臭味，芳香味弱。4 組的莖葉結構均保持良好。C1、CK 的色澤與原料相似，呈淡褐色；C2、C3的色澤略有變色，呈淡黃色或帶褐色。

表2 酶制劑對混合青貯飼料感官質量的影響Table 2 Effect of enzyme preparation on sensory evaluation of mixed silage

2.2 混合青貯飼料的發酵指標

C3的乳酸含量最高，為4.53%，顯著高于C1和CK （P＜ 0.05)，C1和C2無顯著差異（P ＞0.05)；C2的乙酸含量顯著高于C1和CK （P＜ 0.05)；各處理均未檢測到丙酸；C3未檢測到丁酸，其他3 組的丁酸含量也較低，無顯著差異（P＞ 0.05)；各組的V-Score 評分都在96 分以上，符合優質青貯評分范疇。C1、C2和C3的氨態氮/總氮無顯著差異（P＞ 0.05)，但均顯著低于CK （P＜ 0.05) （表3)。

C3的pH 顯 著 低 于C1、C2和CK，其 中CK 的pH 顯著高于其他處理組（P＜ 0.05)；添加劑處理組的pH 均較低，符合優質青貯pH 范疇（表3)。各處理組原料含水量在71.82%～73.73%，處理組間沒有顯著差異（P＞ 0.05)，原料含水量略高于常規青貯適宜含水量（60%～70%) （表3)。

表3 酶制劑對混合青貯飼料發酵品質的影響Table 3 Effect of enzyme preparation on fermentation quality of mixed silage

2.3 混合青貯飼料的營養指標及有氧穩定性

C1的CP 含量顯著高于其他3 個處理組（P＜ 0.05)，CK 最低；C1的NDF 含量顯著低于其他3 個處理組（P＜ 0.05)；各處理組的ADF 含量無顯著差異（P＜ 0.05)；各處理的WSC 含量均較低，其中CK 顯著低于其他3 個處理組（P＜ 0.05) （表4)。

表4 酶制劑對混合青貯飼料營養成分及有氧穩定的影響Table 4 Effect of enzyme preparation on nutrient composition and aerobic stability of mixed silage

C2有氧穩定性最好，達到240 h，C1有氧穩定性達到212 h，而C3和CK 的有氧穩定性較差，分別為50 h 和52 h （表4)。

3 討論

3.1 纖維素酶制劑對青貯品質的影響

纖維素酶和木聚糖酶可降解植物細胞壁中結構性碳水化合物（纖維素或半纖維素等)，產生可溶性碳水化合物，為青貯過程中乳酸菌的繁殖提供底物。青貯飼料中添加纖維素酶和木聚糖酶等酶制劑對青貯飼料發酵品質和營養品質改善效果不盡相同，或受添加酶種類、添加量以及青貯原料種類的影響。張適等[14]在玉米秸稈青貯中分別添加10 000 U·kg-1的纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-葡聚糖酶，結果發現所有酶處理組的氨態氮/總氮顯著降低（P＜ 0.05)，可溶性糖含量顯著升高（P＜ 0.05)；纖維素酶處理組的粗蛋白質含量顯著升高（P＜ 0.05)；β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶處理組的中性洗滌纖維含量顯著低于對照組（P＜ 0.05)。葉杭等[15]發現，隨著木糖酶添加量的增大，低水分（37.5%)水稻秸稈青貯飼料的pH、中性洗滌纖維含量顯著下降（P＜ 0.05)；可溶性碳水化合物含量有上升趨勢，但酸性洗滌纖維含量無顯著影響（P＞ 0.05)。趙金鵬等[16]在添加纖維素酶處理的水稻秸稈青貯時亦發現，青貯60 d 后，與未添加的對照處理組相比，纖維素酶處理組的中性洗滌纖維含量降低幅度（39 g·kg-1)遠大于酸性洗滌纖維含量降低幅度（11 g·kg-1)；且纖維素含量和半纖維素含量均顯著低于未添加對照組（P＜ 0.05)。陳光吉等[17]研究發現，紫花苜蓿和皇竹草（Pennisetum sinese)為主的發酵TMR 飼料中添加纖維素酶和木聚糖酶的復合粉劑（酶活力分別為7 864.26 和3 918.47 U·kg-1)發酵49 d后，發現0.8～1.6 g·kg-1添加量制備的發酵TMR 發酵品質較好（pH 較低)；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著低于對照組（P＜ 0.05)，具有較高的纖維素酶和木聚糖酶活力，另外羧基肽酶和酸性蛋白酶活力均下降，這意味著外源纖維素酶和木聚糖酶的添加促使青貯飼料的纖維素得到分解而降低了蛋白質的損失。本研究中亦發現3 種酶處理組的pH 顯著低于未添加的對照組（P＜ 0.05)；纖維素酶處理組的中性洗滌纖維含量和氨態氮/總氮顯著低于對照組（P＜ 0.05)，木聚糖酶和混合纖維素酶處理組的中性洗滌纖維含量低于對照組，但沒有顯著差異（P＞ 0.05)；3 種酶處理組的酸性洗滌纖維含量與對照亦沒有顯著差異（P＞ 0.05)。乳酸菌[18]、甲酸、糖蜜[19]、纖維素酶或木聚糖酶等青貯添加劑均可降低青貯飼料中性洗滌纖維含量，但青貯添加劑對酸性洗滌纖維含量的影響不盡相同，這可能與中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的組成有關，易降解的部分以半纖維素為主。

3.2 綠狐尾藻混合青貯可行性

綠狐尾藻有發達的根狀莖，在富含氮磷的水體中生長迅速，能高效去除污染的水體（含底泥)中銨態氮、硝態氮、總氮等，常用于建植三級綠狐尾藻表面流人工濕地（三層去污，逐級遞進)處理養豬廢水[20-21]，濕地出水優于《國家畜禽養殖污水排放標準》，本研究采用三級綠狐尾藻表面流人工濕地中第三層濕地生長的綠狐尾藻為試驗材料，前人研究表明，綠狐尾藻植株體內各項離子指標均達到可飼用標準[22]。綠狐尾藻年產鮮草600～900 t·hm-2，平均折合干物質75 t·hm-2。凈化水體后的大量綠狐尾藻急需資源化利用，青貯是飼料化利用的有效方法之一。孫茜等[23]添加不同的乳酸菌劑制備綠狐尾藻青貯飼料，因青貯原料含水量較高（77%)，青貯發酵30 d 后pH 在4.71～5.68，發酵品質較差。而本研究中利用玉米粉、秸稈粉與綠狐尾藻進行混合青貯，降低了青貯原料含水量，且補充了乳酸菌發酵所需的底物，在不添加纖維素酶制劑的情況，仍可獲得較好的發酵品質和營養品質，而添加纖維素酶或木聚糖酶后可有效改善營養品質，并提高有氧穩定性。

本研究中纖維素酶、木聚糖酶和復合纖維素酶制劑的添加劑量參考了飼料添加劑來源公司的推薦量以及之前在紫花苜蓿（Medicago sativa)等同批酶制劑青貯添加劑量預實驗的結果（劑量試驗數據未發表)。從成本效益角度考慮，纖維素酶類添加劑較乳酸菌制劑費用更高，但從本研究結果來看，較乳酸菌制劑，酶制劑能更有效改善綠狐尾藻混合青貯的發酵品質和營養品質和有氧穩定性；在目前研究基礎上，后期可考慮將纖維素酶與乳酸菌或糖蜜等復配添加，降低纖維素酶的添加量，增加綜合經濟效益。另外，還可對綠狐尾藻混合青貯的吸附料選擇、添加劑選擇、綠狐尾藻青貯料飼用價值評價等進行深入研究，以加快綠狐尾藻飼料化進程。

4 結論

以70%綠狐尾藻 + 15%水稻秸稈 + 15%玉米粉為原料可以制備發酵品質較好的青貯飼料；添加酶制劑可以顯著降低pH 和氨態氮/總氮，提高可溶性碳水化合物含量；其中添加纖維素酶（C1)可顯著提高混合青貯飼料的粗蛋白質含量（P＜ 0.05)，顯著降低中性洗滌纖維含量（P＜ 0.05)，且具有較好的有氧穩定性和發酵品質，是綠狐尾藻混合青貯酶制劑添加較好的選擇。