一年生黑麥草遺傳多樣性分析及新品系‘川飼1 號’指紋圖譜構建

程少波，宋 陽，楊巽喆，馬 嘯，周永紅,3，張海琴,3

（1.四川農業大學小麥研究所, 四川 成都 611130；2.四川農業大學草業科技學院, 四川 成都 611130；3.西南作物基因資源發掘與利用國家重點實驗室, 四川 成都 611130）

多花黑麥草（Lolium multiflorum)，又稱一年生黑麥草、意大利黑麥草，是一種冷季型優良牧草，具有生長迅速、產草量高、適口性好、消化率高等特點，具有較高的經濟價值，在歐洲、亞洲、非洲等世界各地種植[1]。截至2021 年，我國共審定登記一年生黑麥草品種19 個，其中，育成品種僅5 個[2]。一年生黑麥草是異花授粉植物，種內不同種質間會發生頻繁的基因交流，導致某一品種不同種子之間的基因構成可能都不相同[3-4]。隨著國家糧改飼及退耕還林還草政策的全面實施，我國各大牧區對優良一年生黑麥草種質的需求日益增長，但目前市場上銷售的一年生黑麥草品種種子混雜，質量較差，品種的一致性也表現較弱，導致農牧民難以按照生產需求選擇合適的品種。因此，對一年生黑麥草品種的正確鑒定顯得尤為重要。

牧草品種鑒定主要有形態學、物理化學、生化和DNA 指紋圖譜等不同方法[5]。目前形態學鑒定方法主要是DUS 測試鑒定法，主要包括特異性（distinctness)、一致性（uniformity)和穩定性（stability)測試[6]，但是DUS 鑒定法存在一定的弊端，測試周期長、耗費大量人力和物力且結果易受環境影響；DNA 分子標記鑒定法從DNA 分子角度鑒別不同品種，多態性高、操作簡便、鑒定結果精準可靠。牧草品種大多來源于野生種馴化和優勢品種雜交[7]，SSR 標記具有穩定性好、共顯性及多態性高等特點，被廣泛應用于牧草的指紋圖譜構建。趙閆閆等[8]利用早熟禾基因組中開發出來的3 對多態性SSR引物對18 個早熟禾（Poa annua)品種進行指紋圖譜構建；陳冬明等[9]利用引物EST-SSR750 構建了9個鴨茅（Dactylis glomerata)材料的指紋圖譜；SSR標記在一年生黑麥草品種鑒定中得到了廣泛應用[10-12]。羅永聰等[10]從來自一年生黑麥草基因組中的100 對SSR 引物中篩選出12 對引物。這12 對引物多態性高，其中引物LMgSSR15-08C 在多個品種中具有特征譜帶，這12 對引物將21 份黑麥草分為三大類，可用作構建多花黑麥草品種指紋圖譜。

‘川飼1 號’一年生黑麥草新品系由四川農業大學小麥族系統學與資源利用研究團隊通過多親本雜交及多次表型輪回選擇法選育而成。母本群體為來自匈牙利的品種‘Billion’ （‘PI 611146’)，具有葉量豐富、葉片顏色深等特性，在四川成都平原上綜合表現較好。父本群體有4 個：“杰威”多花黑麥草，植株直立，莖稈粗壯；來自新西蘭的品種‘G.Manawa’ （‘PI 376875’)，越冬性強；來自瑞典的野生材料‘PI 283610’ （分蘗多)和‘PI 283612’ （種子大、千粒重高)。選育方法：5 份親本群體相鄰種植，去除感病、長勢弱、開花特別早或特別晚的不良植株，剩余優良植株在自然條件下開放授粉，僅在‘Billion’優良植株（母本)上收獲種子。基于產草量、花期及抗病性等性狀進行連續多代輪回選擇，最終獲得性狀穩定且綜合表現較優的新品系328-4，命名為‘川飼1 號’。該品系于2021 年參加國家草品種區域試驗。為建立‘川飼1 號’新品系的DNA 指紋圖譜，本研究利用SSR 分子標記，對‘川飼1 號’及其親本、18 份國審品種構建品種間 SSR 分子標記指紋圖譜，并篩選新品系特異的SSR 指紋圖譜，用于新品系的快速鑒定，并探討品種間的親緣關系，以期為新牧草品系的知識產權保護及品種資源開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共23 份一年生黑麥草，包括‘川飼1 號’及其親本，與18 份在全國牧草品種審定委員會登記的國審品種。PI 編號材料由美國國家植物種質資源庫 （National Plant Germplasm System，Pullman，Washington，USA) 提供。材料來源信息如表1 所列。

表1 供試材料Table 1 The materials used in this study

1.2 DNA 提取

將種子置于雙層濾紙上發芽，25 ℃恒溫培養箱中培養，7 d 后選取新鮮的葉片采用改良CTAB 法[13]提取DNA。每個材料隨機選取40 株單株葉片等量混合提取DNA。新品系‘川飼1 號’提取2 份DNA（各40 株葉片等量混合，命名為6-1 和6-2)。

1.3 引物合成

本研究選取羅永聰等[10]從100 對SSR 引物中篩選出的12 對高多態性引物構建一年生黑麥草新品種（系)指紋圖譜。引物由生工生物工程（上海)有限公司合成，引物信息如表2 所列。

表2 12 對SSR 引物序列信息Table 2 Sequence information of 12 pairs of SSR primers

1.4 SSR-PCR 擴增及毛細管電泳檢測

PCR 擴增反應總體積為20 μL，其中PCR-Mix （北京天根生化公司) 10 μL，正、反向引物各0.8 μL （10 pmol·μL-1)，模 板DNA 2 μL （10 ng· μL-1)，Taq DNA聚合酶0.4 μL （2.5 U·μL-1)，ddH2O 補足體積。PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min；10 個降落PCR 循環：94 ℃變性30 s，退火溫度由 65 ℃開始，每個循環降低 0.5 ℃，直至60 ℃，退火45 s，72 ℃延伸1 min；30 個循環：退火溫度為60 ℃，變性和延伸溫度同上；72 ℃延伸7 min，10 ℃保存。PCR 擴增所得產物用ddH2O調濃度至100 ng·μL-1，然后將樣品上樣至Agilent Fragment Analyzer 上進行毛細管電泳檢測。

1.5 數據統計與聚類分析

用PROSize 3.0 軟件對毛細管電泳得到的原始數據進行分析。僅統計每對引物目標片段 ± 50 bp范圍內的片段（此范圍外的片段為非特異產物)[14]。在相同擴增片段上有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，在Excel 表格中將SSR 原始數據轉化為0/1 矩陣。統計擴增產物的條帶總數（total No.of bands, TNB)和多態性條帶數量（No.of polymorphic bands, NPB)并計算多態性百分率（percentage of polymorphic bands,PPB)。用DataFormater 軟件[15]將SSR 0/1 矩陣轉化為Popgene 1.32 軟件的格式，利用該軟件統計每對引物在23 個一年生黑麥草材料當中的等位基因頻率、香∑ 農 信 息 指 數（Shannon’s information index, I)，I=-Piln(Pi/n)，Pi為第i個等位變異的頻率，n為檢測到的位點總數及Nei’s 多樣性指數（Nei’s gene diversity, H)。利用PIC-CALC 0.6 軟件計算每個S co SnRt e位nt,點PI的C)多，P態IC性=信1-息∑量（p，l o其y m中o rpPhii為s m第i nfio個r m等a ti位on變異的頻率。采用NTSYS-pc2.10e 軟件計算Dice 遺傳相似系數，按UPGMA （unweighted pair group method using arithmetic averages，非加權成對算術平均法)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SSR 標記多態性分析

12 對SSR 引物對23 份一年生黑麥草品種（系)進行PCR 擴增，共擴增出104 條多態性條帶，12 對引物擴增的條帶數變化范圍為4～14 條，平均每對引物擴增出8.667 條帶（表3、圖1)。

多態性信息量（PIC)是衡量座位多態性高低程度的指標[16-18]。PIC 變化幅度為0.392～0.822，引物LMgSSR01-02G 的PIC 最低，為0.392，引物LMgSSR 02-12E 的PIC 最高，為0.822，平均多態性信息含量為0.613 （表3)。

香農指數（I)常用于評估種群遺傳多樣性，數值越大多樣性越豐富[19-21]。12 對引物香農指數變化范圍為0.911～2.061，平均為1.325。基因多樣性指數（H)是一個種群中每個位點上平均期望雜合度，具有較高H 值的SSR 標記具有較高的檢測效率[19]。12 對引物的H 變幅為0.407～0.838，平均基因多樣性指數為0.650 （表3)。

表3 12 對SSR 引物的多態性及遺傳多樣性參數Table 3 The polymorphism and genetic diversity parameters of 12 SSR primers

2.2 聚類分析

UPGMA 聚類分析結果表明，23 份一年生黑麥草材料在相似系數0.725 處分為三大支，第一大支包括‘川飼1 號’及其親本供體，其中‘川飼1 號’與品種‘Billion’ （母本)和‘杰威’聚為一小支，2 份野生材料‘PI 283610’、‘PI 283612’及‘G.Manawa’聚為另一小支；第二大支為12 個國審品種，其中‘川農1 號’、‘贛選1 號’、‘阿德納’和‘長江2 號’聚為一個小支，另外‘贛飼3 號’等8 個品種聚為另外一小支；第三大支為‘邦德’、‘特高’和‘劍寶’等5 個品種（圖2)。以上結果表明：‘川飼1 號’與親本供體（特別是母本)親緣關系較近，而與其他一年生黑麥草國審品種差異較大，親緣關系較遠。

圖2 23 份一年生黑麥草品種(系)SSR 標記的UPGMA 聚類圖Figure 2 UPGMA cluster based on SSR markers in 23 varieties of Lolium multiflorum

‘川飼1 號’的2 個重復（6-1，6-2)不同引物的所有擴增條帶基本一致，遺傳相似系數高達93%，表明‘川飼1 號’這一新品系遺傳差異小，為穩定的遺傳群體。該結果同時也表明本研究的PCR 反應體系比較穩定，重復性較好。

2.3 新品系指紋圖譜構建

分析‘川飼1 號’新品系與其他品種的SSR 擴增條帶，結果發現：引物LMgSSR02-12E 在‘PI 283 610’、‘G.Manawa’和新品系上的238 bp 處有特異條帶，其他國定品種沒有出現該條帶（圖1 箭頭所示)。因此，以上引物可用來構建‘川飼1 號’的指紋圖譜，用于新品系的快速鑒定。

圖1 部分SSR 引物毛細管電泳圖Figure 1 Capillary electrophoresis with partial SSR primers

3 討論與結論

一年生黑麥草為優良牧草，在我國特別是南方地區廣泛種植。品種種子的質量和純度是種子管理的核心工作[22]。由于一年生黑麥草為異花授粉植物，因此市場流通中種子混雜、質量較低的現象較為普遍。DNA 指紋圖譜的構建是以分子標記為基礎，指紋圖譜多態性豐富，具有高度的個體特異性而且不易受環境影響，同時相比形態標記的DUS 測試具有快速、準確的特點，因此指紋圖譜是鑒別品種、品系（含雜交親本、自交系)的有力工具。指紋圖譜主要包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SNP圖譜等[23]。因SSR 標記具有多態性高、重復性好及共顯性的特性，使其成為品種DNA 指紋分析較為理想的技術[24-27]。劉歡等[28]用30 對EST-SSR 引物中的25 對多態性引物構建了10 個一年生黑麥草品種的指紋圖譜；蒙宇和王譽緋[29]用23 對引物對45份多年生黑麥草進行遺傳多樣性分析；Nie 等[30]利用SSR 標記對6 份四倍體多花黑麥草進行遺傳變異性評價及品種鑒定。本研究選用羅永聰等[10]從100 對SSR 引物中篩選出的12 對高多態性引物，對18 份國審多花黑麥草品種進行分析并構建川飼1 號新品系的SSR 指紋圖譜。12 對SSR 引物均表現出多態性，且Shannon 信息指數（I)及多態性信息含量（PIC)平均值分別為1.325 和0.613。羅永聰等[10]的研究中平均PIC 為0.843，其中引物LMgSSR15-08C的PIC 最高為0.934，而本研究該引物PIC 為0.637。有研究表明引物PIC 與群體遺傳變異程度成正相關[31]，推測可能部分相同材料發生了遺傳變異，導致某些特異標記的丟失或增加，同時本研究所用材料與羅永聰等[10]的研究材料只有12 份一致，剩余11 份材料包括其他國審多花黑麥草品種和新品系‘川飼1 號’及其親本，從而導致本研究引物PIC 值與羅永聰研究不一致。當PIC ≥ 0.5，為高度多態位點，表明這些引物多態性較高，適宜用于一年生黑麥草品種SSR 指紋圖譜的構建。

本研究的分子標記結果可以很好地反映多花黑麥草品種間遺傳多樣性及親緣關系。部分具有親緣關系的品種聚為一類，如‘川農1 號’和‘贛選1 號’聚為一小支，而‘贛選1 號’是‘川農1 號’的親本之一；‘長江2 號’多花黑麥草是以‘阿伯德’和‘贛選1 號’為育種親本材料，進行多次混合選育而成，在本研究中，‘贛選1 號’和‘長江2 號’聚為一個小支，而‘阿伯德’并未聚在同一支上，推測可能是由于‘阿伯德’多花黑麥草在育種過程中的多次混合選擇作用，導致品種群體的特異位點基因頻率發生改變。羅永聰[10]等研究中的‘特高’和‘杰威’聚類較近，而本研究中的‘特高’則與‘邦德’和‘達伯瑞’等聚為一支，聚類結果與Nie 等[30]的研究類似，由于大部分的國審多花黑麥草為引進品種很難獲得系譜關系，加之材料異花授粉的特性，導致難以分析品種間的系譜關系，但本研究中系譜來源已知的材料聚類結果與系譜關系一致。因此，這些SSR 標記可以用于多花黑麥草品種的快速鑒定。

‘川飼1 號’是由5 個親本（‘Billion’、‘杰威’、‘G.Manawa’、‘PI283610’和‘PI 283612’)經雜交及輪回選擇選育而來，母本為‘Billion’。本研究利用SSR 分子標記鑒定了‘川飼1 號’的來源，聚類結果表明：新品系‘川飼1 號’與5 個親本材料聚為一大支，而其他17 份國審品種聚為另外一支，表明‘川飼1 號’與5 個親本材料親緣關系較近，而與其他國審品種關系較遠。分子結果與實際選育過程一致。利用優良品種雜交創造變異或從自然群體變異中進行優良單株選擇是植物新品種選育的重要手段[32]。親本間的遺傳相似性越小，從雜交后代中獲得優良單株的機率就越高，因此，利用DNA 分子標記技術充分了解親本的遺傳背景為雜交品種和優良單株選育提供了參考。

引物LMgSSR02-12E 在新品系上擴增出大小為238 bp 的特有條帶，其他材料都沒有該帶（圖1)。該引物可用來構建‘川飼1 號’的指紋圖譜，用于材料的快速鑒定。