IGFBP-4對A549細胞免疫原性細胞死亡的作用及其機制

藍秀，李偉文，孫蕾，黎媛，趙嘉璐

溫州醫科大學附屬第五醫院 呼吸科，浙江 麗水 323000

據報道，肺癌年發病例數高達182萬以上，每年約有160萬例肺癌患者死亡[1]，其中非小細胞肺癌占肺癌發病總數的85%，且以中晚期肺癌為主，5年存活率也小于15%[2-3]。研究發現多種藥物不僅能誘發腫瘤細胞死亡，還能促進瀕死細胞釋放免疫原性，促使細胞發生免疫原性凋亡，即為免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）。探索有效刺激的方法和途徑已是腫瘤免疫治療的熱點話題[4-6]。IGFBP-4是細胞內最小的胰島素樣生長因子結合蛋白（insulin-like grouth factor binding protein，IGFBPs），可分泌至細胞外，發揮生物學功能，研究表明肺癌組織中IGFBP-4低表達促使細胞增殖、遷移，IGFBP-4缺乏是肺癌不良預后的重要原因[7-8]，然而，IGFBP-4對ICD的影響及機制仍未明確。本研究重點關注外源性IGFBP-4對ICD的影響，并初步探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 重組人IGFBP-4 蛋白（批號：804-GB-025，純度≥97%），購自美國R&D Systems公司，N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC，批號：ST1546）、ROS檢測試劑盒（批號：S0033）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（WST-8法，批號：S0101）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號：S0131）購自上海碧云天生物技術有限公司。p38 siRNA質粒（sc-29433）、磷酸化（p）-p38抗體（sc-166182）、p38抗體（sc-81621）、Actin抗體（sc-8432）購自圣克魯斯生物技術（上海）有限公司。Calreticulin抗體購自英國Abcam公司，高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）ELISA試劑盒購自Arigo Biolaboratories公司（中國臺灣），A549肺癌細胞購自中國醫學科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與傳代：用10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM杜爾伯科改良伊格爾培養基培養，將A549細胞接種于培養皿后，置入37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養。隔日更換1次培養基，待細胞融合大于80%時傳代培養。

1.2.2 實驗分組：將A549細胞分為對照組、IGFBP-4 組、IGFBP-4+NAC組和IGFBP4+si-p38組。IGFBP-4組細胞予50 ng/mL IGFBP-4處理；IGFBP-4+NAC組細胞予5 μmol/L NAC預處理12 h后，再用50 ng/mL的IGFBP-4處理。IGFBP-4+si-p38組用p38 siRNA質粒預處理12 h后，再用50 ng/mL的IGFBP-4處理。對照組用等量的PBS處理。

1.2.3 MTT法檢測IGFBP-4對細胞生長存活的影響：將2×103個/mL的A549細胞接種于96孔板，每孔 200 μL，置于培養箱貼壁培養后，按照分組方法加藥后，繼續培養48 h。取出96孔板，加入20 μL MTT，37 ℃溫箱反應1～2 h，再加入二甲基亞砜（DMSO）120 μL終止反應。用酶標儀在492 nm波長處檢測A值。計算細胞存活率=（濃度A值-空白孔A 值/對照組A值-空白孔A值）×100%。

1.2.4 流式細胞儀技術檢測鈣網蛋白（calreticulin， CRT）表達：將1×105個/mL的A549細胞接種于6孔板，每孔200 μL，置于培養箱貼壁培養后，按照分組方法加藥后，繼續培養48 h。收集細胞，并用PBS重懸細胞，調整細胞5×106個/mL。取500 μL細胞懸液加入適量的兔抗人CRT多克隆抗體（按1:1 000比例稀釋），在室溫條件下，孵育30 min；經PBS洗滌3次后，加入適量的PE標記的羊抗兔IgG多克隆抗體，在室溫條件下，孵育1 h，再次用PBS洗滌后上機檢測。

1.2.5 ELISA法檢測培養基中HMGB1釋放：將1× 105個/mL的A549細胞接種于6孔板，每孔200 μL，置于培養箱貼壁培養后，按照分組方法加藥后，繼續培養48 h。收集細胞培養基，離心去除細胞、顆粒等雜質后，根據HMGB1 ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測HMGB1的釋放量。

1.2.6 酶標儀技術檢測細胞內SOD和MDA的含量：將1×105個/mL的A549細胞接種于6孔板，每孔200 μL， 置于培養箱貼壁培養后，按照分組方法加藥后，繼續培養48 h。收集細胞，并用PBS重懸細胞，調整細胞5×106個/mL。根據總SOD活性檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒說明書進行操作后上機檢測，設置吸收波長為450 nm。

1.2.7 二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-CA）法檢測細胞內ROS含量：將1×105個/mL的A549細胞接種于6孔板，每孔200 μL，置于培養箱貼壁培養后，按照分組方法加藥后，繼續培養48 h。收集細胞，并用PBS重懸細胞，調整細胞5×106個/mL。按照ROS試劑盒檢測方法，取終濃度為10 μmol/L的DCFH-CA重懸細胞，置入37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，以無血清細胞培養液洗滌3 次后，轉至流式細胞儀，使用488 nm激發波長，525 nm發射波長檢測。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達：按照分組條件處理細胞后，用120～150 μL RIPA裂解液冰上裂解10～15 min，并收集細胞裂解液。取20 mg總蛋白用4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠置于伯樂電泳儀（Bio-Rad）電泳分離，電轉至PVDF，3%脫脂牛奶室溫封閉30～60 min。加入一抗4 ℃孵育過夜后，加入HRP標記二抗，室溫孵育1～2 h，用ECL試劑發光、顯影和定影，用Image J軟件測量各個條帶的灰度值。計算蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS24.0軟件進行統計分析。正態分布計量資料以±s表示，用單因素方差分析進行顯著性檢驗，組間兩兩比較采用SNKq檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IGFBP-4抑制細胞增殖 與對照組比較，IGFBP-4 組細胞存活率顯著降低（P＜0.05）；與IGFBP-4組比較，IGFBP-4+NAC組和IGFBP-4+si-p38組細胞存活率顯著升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 IGFBP-4抑制細胞增殖

2.2 IGFBP-4抑制A549細胞p-p38和p38的表達 與對照組比較，IGFBP-4組p-p38和p38表達顯著升高（P＜0.05）；與IGFBP-4組比較，IGFBP-4+NAC組和IGFBP-4+si-p38組p-p38和p38表達顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 IGFBP-4誘發A549細胞氧化應激 與對照組比較，IGFBP-4組ROS、MDA顯著升高，SOD顯著下降（P＜0.05）；與IGFBP-4組比較，IGFBP-4+NAC組和IGFBP-4+si-p38組ROS、MDA顯著降低，SOD顯著增高 （P＜0.05）。見圖3。

2.4 IGFBP-4誘發A549細胞發生ICD 與對照組比較，IGFBP-4組HMGB1、CRT顯著升高（P＜0.05）；與IGFBP-4組比較，IGFBP-4+NAC組和IGFBP-4+si-p38組HMGB1、CRT顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

IGFBP-4是分子量最小的IGFBPs家族成員，能分泌到細胞外，與IGF競爭結合IGF受體，即激活IGF依賴途徑，抑制IGF的生物學功能。研究表明IGFBP-4可通過非IGF依賴途徑抑制腫瘤細胞的生長[7-9]。 前期研究證實IGFBP-4顯著下調A549細胞內COX-2的表達，抑制A549細胞遷移和侵襲[8]。本研究中，我們發現IGFBP-4處理后A549細胞存活率顯著下降，細胞內ROS、MDA的含量增加，SOD水平降低，用氧自由基清除劑NAC處理后，細胞存活率較IGFBP-4組明顯升高，說明IGFBP-4通過誘發A549細胞氧化應激，抑制細胞存活。

ICD是指細胞接受化療藥物、消融、放射等外部因素刺激后，瀕臨死亡的腫瘤細胞功能改變，并釋放CRT、HMGB1等信號分子，激活抗原特異性T細胞免疫應答的過程[6]。本研究發現IGFBP-4處理后，A549細胞膜上的CRT和HMGB1含量顯著增加，提示IGFBP-4能夠誘發A549細胞ICD的發生，而用NAC處理后，CRT和HMGB1含量顯著下降，提示A549細胞發生ICD與細胞內氧化應激有關。

圖2 IGFBP-4抑制細胞p-p38和p38的表達

圖4 IGFBP-4促進A549細胞分泌HMGB1、CRT表達

p38是MAPK信號通路關鍵激酶，p38激活能促進其下游分子表達，調控細胞的增殖、存活和死 亡[10-12]。p38還能介導多種細胞因子的表達，參與炎癥反應[13]。研究發現藥物誘發p38 MAPK通路活 化，能夠刺激腫瘤細胞發生ICD，進而發揮抗腫瘤作用[14]。本研究發現IGFBP-4處理后，細胞內p38和p-p38表達顯著增加，提示IGFBP-4激活了p38 MAPK信號通路。利用si-RNA降低A549細胞內源性p38的表達后，本研究發現si-p38顯著下調CRT和HMGB1表達，增加細胞的存活性，提示IGFBP-4通過p38促使A549細胞發生ICD，這與既往研究[14]結果類似。本研究還發現si-p38 能顯著降低IGFBP-4 誘導的ROS、MDA含量增高，增加SOD的含量，提示p38還與IGFBP-4誘導ROS升高有關。

綜上所述，IGFBP-4能夠激活p38 MAPK信號通路，誘發細胞內氧化應激，促使細胞發生ICD，抑制A549肺癌細胞增殖，進而發揮抗腫瘤作用。