EGFL6在胃癌中的表達及其與預后的關系

李利義，涂富洋，尤孫武，沈雷斌，游濤，鄭志強

1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325027；2.溫州市人民醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325000

截至2016年，全球有近120萬胃癌突發病例，發病率增加了15%[1]。化療及手術治療仍是當前對多數進展期胃癌的首要治療方式，盡管取得了進展，但胃癌的長期存活率仍不能令人滿意。表皮生長因子樣蛋白（epidermal growth factor like，EGFL）家族含多個重復表皮生長因子表達，并通過與其受體結合觸發多種生物學功能，如血管生成、增殖、凋亡、細胞周期調節、遷移和侵襲[2]。EGFL7已被證明在癌癥發生發展中起作用[3]。EGFL6作為一種分泌蛋白，其結構同源性位于人Xp22染色體上[4]。 EGFL6能通過細胞外信號調節激酶刺激內皮細胞的增殖和遷移，并在基質血管細胞的黏附和增殖中起到作用[5]。EGFL6的表達改變已在多種癌癥中被檢測到，如卵巢癌[6]、結腸癌[7]等；但EGFL6在胃癌發生發展中的作用知之甚少。本研究的目的旨在探究EGFL6在胃癌患者中的表達和作用，探討EGFL6表達水平與胃癌臨床病理特征及預后之間的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2016年3月至2018年2月間溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院接受胃癌根治手術切除的原發性胃癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）各80例，其中男50例，女30例，年齡（62±11）歲；所有患者術前均經病理學證實，且均未接受放療或化療。所有患者均接受標準的胃癌根治術，術后治療統一按照美國國立綜合癌癥網絡胃癌臨床實踐指南執行。

1.2 免疫組織化學染色 通過DAB染色法檢測EGFL6在胃癌及癌旁組織中的表達。石蠟包埋的胃癌組織切片在二甲苯中脫蠟、水化，用3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶活性10 min后，進行抗原熱修復。用10%的山羊血清進行抗原封閉，后滴加純化的單克隆兔抗人EGFL6抗體（稀釋度1:100，英國Abcam公司）作為一抗處理胃癌切片。在4 ℃下pH 7.4中孵育16 h，37 ℃下復溫30 min。滴加酶標山羊抗兔二抗在室溫中孵育30 min，DAB顯色試劑顯色，蘇木精復染，脫水，封片，顯微鏡下觀察，用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替I抗，作為陰性對照。癌旁組織也按照上述方法進行操作。結果判定：在胃癌及癌旁組織切片中EGFL6陽性表達的細胞主要表現為細胞質、細胞膜染為棕黃色。判定標準：采用雙盲法計數10個高倍視野，陽性細胞數＜10%為陰性，≥10%為陽性，同時忽略較弱或可疑的染色。

1.3 隨訪 由病理學專家組根據第8版TNM分期系統對臨床和組織學分類進行分組。對所有術后患者每3至6個月通過信函或電話進行隨訪，隨訪時間為3年，最后1次隨訪時間為2020年9月30日。在前3年內每3至6個月進行胃鏡、腹部CT或增強CT掃描評估疾病狀態。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。計數資料比較用χ2檢驗，生存曲線用Kaplan-Meier法比較，生存率比較用Log-rank檢驗，預后影響因素用COX比例風險回歸模型進行評估。 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFL6在胃癌組織中的表達 EGFL6在胃癌組織中主要表達于腺細胞的細胞質和細胞膜中，陽性表達呈黃棕色顆粒，在鄰近癌旁組織中EGFL6呈陰性或弱陽性表達，見圖1-2。

圖1 胃癌組織EGFL6陽性表達（DAB染色，×100）

圖2 鄰近癌旁組織EGFL6陰性表達（DAB染色，×100）

2.2 EGFL6在胃癌及癌旁組織中的表達差異 在80例胃癌組織中，陽性表達者有54例（67.5%）；在80例對應癌旁組織中，陽性表達者有11例（13.75%），胃癌組織中EGFL6 的表達顯著高于鄰近癌旁組織，差異有統計學意義（χ2=47.909，P＜0.01）。

2.3 EGFL6表達與胃癌臨床病理因素的關系 EGFL6 表達與胃癌患者腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期有關（P＜0.05），見表1。EGFL6蛋白的表達、年齡、腫瘤直徑、細胞分化、浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期均與胃癌患者的預后相關（P＜0.05），見表2。

2.4 EGFL6與胃癌預后的關系 EGFL6陰性表達患者的3年中位無病生存率（88.5%）較陽性表達患者（64.8%）高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。COX回歸模型分析顯示，年齡、腫瘤直徑、細胞分化程度是影響胃癌術后患者預后的獨立因素，見表3。

3 討論

EGFL6可以在體內外促進腫瘤細胞的遷移和增殖。據已有研究數據顯示，EGFL6在內皮細胞增殖和血管生成中起到作用，并促進結直腸癌的侵襲和轉移[8]。部分表皮生長因子家族蛋白，如人肝素結合性表皮生長因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）已被證明在細胞癌變的過程中發揮重要作用[9]，并且能作為癌癥的預后指 標[10]。有研究報道EGFL6參與了人類癌癥的進展[2]，如卵巢癌[6]、乳腺癌[11]、肺癌[12]等，并且EGFL6已被證明是卵巢癌患者生存率低的預測因子[6]。

表1 EGFL6表達與胃癌患者臨床病理因素的關系（例）

本研究表明了EGFL6與胃癌的發生、發展有關。EGFL6蛋白的表達、患者的年齡、腫瘤直徑、細胞分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期均與胃癌術后患者的預后相關，提示EGFL6的高表達是胃癌患者預后不良的重要分子標志。但EGFL6的表達程度與腫瘤的分化程度及腹膜轉移無明顯相關性。且COX多因素生存分析提示EGFL6的表達并非胃癌預后的獨立因素，究其原因可能與樣本容量不足以及胃癌的早期發現與治療有關，需進一步擴充樣本量驗證。

表2 80例胃癌患者臨床病理因素與預后的關系（例）

圖3 EGFL6陽性表達與陰性表達胃癌患者的生存曲線

關于EGFL6在癌癥中的作用機制，ZHANG等[13]指出EGFL6可以通過調節WNT/β-catenin信號傳導途徑，誘導β-catenin及其下游蛋白CyclinD1表達，促進結直腸癌細胞生長，在結直腸癌的進展中起關鍵作用。PI3K/AKT通路已被確定是參與腫瘤細胞凋亡的重量信號通路之一，其通路的激活能促進腫瘤細胞的生長和進展，ZHU等[14]研究發現AKT的磷酸化受細胞內EGFL6水平的影響，并呈現正相關，在鼻咽癌細胞中沉默EGFL6時AKT信號通路受到抑制從而表現出腫瘤生長的停滯，表明EGFL6可以通過激活AKT通路促進鼻咽癌細胞的遷移。EGFL6的表達可以使上皮間質發生轉化，此過程參與了腫瘤的發生，通過增強細胞的遷移、侵襲和抗凋亡能力，使腫瘤細胞惡性程度增高，賦予癌細胞轉移特性。但EGFL6在胃癌中的作用機制目前鮮有研究，本研究表明EGFL6與胃癌的部分臨床病理因素具有相關性，下一步將采用抗EGFL6的單克隆抗體阻斷EGFL6表達以控制胃癌細胞的增殖，深入研究EFGL6在胃癌細胞中的作用機制及相關信號通路調節的影響，為利用EGFL6的生物學特性設計靶向藥物治療胃癌提供有價值的實驗基礎。

表3 胃癌患者預后的多因素COX回歸分析結果

本研究顯示EGFL6的表達在臨床分析中與胃癌患者存在相關性，提示EGFL6在胃癌的發生發展中起重要作用。EGFL6的檢測有望成為胃癌分子診斷和病期評估的標志之一，為胃癌的治療提供一個新的分子靶標。