微陣列芯片技術在頸項透明層增厚胎兒診斷中的應用價值

周麗麗，溫鄭靜，徐晨陽，李煥錚，徐雪琴，唐少華

溫州市中心醫院 檢驗科，浙江 溫州 325000

頸項透明層（nuchal translucency，NT）厚度是指胎兒頸椎水平矢狀切面皮膚至皮下軟組織之間的最大厚度，反映了胎兒頸后皮下淋巴液的積聚程度，是孕早期（11～13+6周）篩查胎兒染色體異常的最佳超聲軟指標。胎兒頭臀長45 mm時，95%百分位數NT厚度為2.1 mm，胎兒頭臀長84 mm時，95%百分位數NT厚度為2.7 mm，99%百分位數NT厚度不隨頭臀長增加而改變[1-2]。2016年ACOG指南指出，孕11～14周NT＞3.0 mm或大于相應胎兒頭臀長的99%百分位數視為NT增厚[3]，而國內各醫療機構對NT增厚的截斷值尚未統一，其值從2.0～5.0 mm不等[4-5]， 將NT 2.5～3.0 mm視為臨界增厚，NT＞3.0 mm判斷為增厚最為常見。

1992年，NICOLAIDES等[6]首先發現孕早期胎兒NT的增厚與唐氏綜合征密切相關。NT除與染色體數目異常相關外還與致病性染色體拷貝數變異（copy number variations，CNVs）存在相關性，檢出率為0～15%[7-11]。傳統的染色體核型分析技術只能檢測片段5～10 Mb的染色體畸變，而染色體芯片技術（chromosomal microarray，CMA）可將分辨率提高到100 kb，能在全基因組范圍內檢測染色體CNVs[12]。單核苷酸多態性微陣列芯片（single nucleotide polymorphism array，SNP array）技術是一種較新的CMA，可以檢出染色體微缺失、微重復和雜合性缺失，近年來已被廣泛運用到先天性異常、認知缺陷、發育遲緩或行為問題的診斷中[13]。本研究聯合應用染色體核型分析技術與SNP array技術，對220例孕早期超聲NT增厚的胎兒進行檢測，明確NT增厚胎兒的遺傳學病因，分析胎兒NT增厚與染色體異常及CNVs之間的相關性，探討SNP array在NT增厚胎兒產前診斷中的臨床價值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選擇2013年8月至2019年4月在溫州市產前診斷中心進行產前診斷，妊娠11～13+6周超聲篩查提示胎兒NT＞2.5 mm的孕婦220例，孕婦年齡21～44歲，中位年齡31歲，NT厚度2.5～9.0 mm， 中位厚度3.4 mm。所有孕婦均簽署知情同意書，并進行臨床資料登記，包括年齡、家族史、接觸史、產前診斷結果等。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理：無菌條件下穿刺取材。孕11～13周的孕婦選擇超聲引導下經腹絨毛膜穿刺術，抽取少量絨毛組織；孕16～24周的孕婦選擇超聲定位下經腹羊膜腔穿刺術，抽取30 mL羊水；孕25～38 周的孕婦選擇超聲定位下經腹臍靜脈穿刺術，抽取臍靜脈血2～3 mL。

1.2.2 染色體核型分析：采用常規方法行絨毛、羊水和臍血細胞培養、收獲、固定、核型制備和G顯帶。染色體異常的分析和描述標準依照《人類細胞遺傳學國際命名標準2016版》。

1.2.3 DNA提取：采用博爾誠公司的基因組DNA提取試劑盒，提取總DNA，用Nano Drop 2000UV-vis測定DNA純度和OD值（λ260/λ280），OD值1.8～2.0為合格，并在管外壁上做好記錄。

1.2.4 SNP array技術檢測：采用Human Cyto SNP- 12 DNA Analysis Beadchip Kits（Illumina，USA）芯片，按照標準的操作手冊進行全基因組擴增、DNA片段化、雜交、洗脫、單堿基延伸及染色、洗滌、包被及芯片掃描；或采用Affymetrix CytoScanTM750K Arrays（Affymetrix，USA）芯片，按照標準的操作手冊進行全基因組DNA酶切、連接、PCR擴增、純化、片段化、標記、芯片雜交、洗滌及掃描。

1.2.5 數據轉換及全基因組拷貝數分析：使用KaryoStudio軟件或ChAS 2.0軟件轉換原始數據，并進行全基因組拷貝數CNVs分析。首先將得到結果與已有的正常人群DGV數據庫（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）進行比對分析，若發現CNVs在該數據庫中有報道，則將其視為多態性的CNVs或正常的CNVs；再與DECIPHER數據庫（http://decipher.sanger.ac.uk/）比對分析，是否為已報道明確癥狀的綜合征。對于仍然無法確定致病性的CNVs查詢PubMed數據庫，是否有相關文獻報道。對于缺失或重復區域的基因功能查詢OMIM（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/）及GENE（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）等數據庫。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS18.0進行統計學處理。采用χ2檢驗進行比對分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果 220例產前標本，包括絨毛16例，羊水189例，臍血15例，染色體核型分析檢出32例異常，異常率為14.5%。染色體數目異常占87.5%，結構異常占12.5%。染色體數目異常中21 三體綜合征最常見（占43.8%），其次是18三體綜合征（占21.9%），還包括13三體綜合征2例（占6.2%），Turner綜合征4例（占12.5%），性別染色體嵌合1例（占3.1%）。同時檢出羅伯遜易位1例和染色體多態性8例。結果見表1。4例染色體結構異常的核型圖見圖1。

表1 32例NT增厚胎兒異常核型及SNP芯片結果

圖1 4例染色體結構異常的核型圖和芯片圖

2.2 SNP array分析結果 在染色體核型結果正常的NT增厚胎兒中，SNP array額外檢出致病性CNVs 5例，疑似致病性CNVs 4例。除1例大片段嵌合型重復，其余8例均為微缺失或微重復，大小0.54～10.10 Mb，包括1例DiGeorge綜合征和2例Williams-Beuren綜合征，結果見圖2。SNP array技術染色體異常檢出率為18.6%，與染色體核型分析（為14.5%）相比，提高了4.1%。另外，6.82%（15/220）的標本攜帶意義未明CNVs。結果見表2。

2.3 NT厚度與胎兒染色體異常及CNVs的相關性分析 按NT厚度2.5～2.9 mm、3.0～3.4 mm及≥3.5 mm將病例分3組，當NT≥3.5 mm時，SNP array技術在NT增厚胎兒中共檢出31例異常CNVs，與單純核型分析檢出24例相比，差異有統計學意義（P＜0.05），而NT厚度為3.0～3.4 mm時，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。結果見表3。

圖2 8例微缺失或微重復SNP array圖

3 討論

NT厚度被公認為產前篩查染色體異常和多種胎兒畸形的有效超聲軟指標。NT增厚胎兒中，大約20%存在染色體異常[14]。SNIJDERS等[1]調查了96 127例NT增厚胎兒，發現染色體異常中約50%為21三體綜合征，25%為18三體綜合征或13三體綜合征，10%為Turner綜合征，5%為三倍體，10%為其他染色體異常。本組220例NT增厚胎兒中，染色體核型分析檢出32例異常，異常率為14.5%，數目異常占87.5%，結構異常占12.5%，其中21三體綜合征14例（占43.8%），其次是18三體綜合征7例（占21.9%），13三體綜合征2例（占6.2%），Turner綜合征4例（占12.5%），性別染色體嵌合1例（占3.1%）和染色體結構異常4例（占12.5%），除未見三倍體外，其余與文獻相符。

NT增厚除與染色體數目異常密切相關外，還與致病性染色體CNVs存在相關性，異常率約0～15%[7-11]。 PAN等[15]對122例熒光定量聚合酶鏈反應（QF-PCR）檢測結果正常的NT＞3.5 mm病例行CMA檢測，可額外檢出致病性CNVs 7例（占5.7%），其中3例微缺失/微重復無法被傳統的核型分析識別。LEUNG等[16]發現，微缺失/微重復綜合征在染色體核型正常的NT增厚胎兒中發生率約10%，若中期合并其他超聲結構異常，微缺失/微重復發生率則更高。本研究通過SNP array技術明確了4 例染色體核型結構異常的片段性質，同時在染色體正常胎兒中額外檢測出9例異常CNVs，5例致病性CNVs和4例疑似致病CNVs。因此，聯合應用SNP array檢測可提高NT增厚胎兒染色體CNVs的檢出率，同時可明確染色體結構異常的片段性質，為臨床遺傳咨詢提供理論依據。

本研究檢出的3例致病性CNVs為DiGeorge綜合征和Williams-Beuren綜合征。DiGeorge綜合征（22q11.2微缺失綜合征）由22q11.2上約3 Mb的片段缺失引起的，是最常見的染色體微缺失綜合征之一，新生兒發病率為1/4 000，主要臨床表型為心臟缺損、免疫缺陷、語言延遲，腭咽閉合不良、行為和精神異常、特殊而容和低鈣血癥等[17]。約94% DiGeorge綜合征病例的缺失是新生的，6%則遺傳自父母中的一方[18]。Williams-Beuren綜合征是指由7q11.23上約1.5 Mb的片段缺失引起的，新生兒發病率為1/25 000～1/7 500，主要臨床表型為心血管系統疾病、特殊面容、智力低下、神經行為異常 等[19]。

表2 9例核型正常的SNP array檢測結果

表3 不同NT厚度組間異常檢出率的比較[例（%）]

近年研究發現，早孕期的NT增厚與染色體異常、主要先天畸形、圍產期胎兒損失以及不良結局相關，并隨著NT增厚的程度風險逐漸加大。NT厚度2.5～ 3.5 mm時，異常率為3.7%，NT厚度3.5～4.4 mm時為21.1%，NT厚度4.5～5.4 mm時為33.3%，NT厚度5.5～6.4 mm時為50.5%，NT厚度≥6.5 mm時為64.5%[20]。本研究按NT厚度2.5～2.9 mm、3.0～ 3.4 mm及≥3.5 mm將病例分3組，核型異常率分別為5.6%、7.9%和23.3%，SNP array異常率分別為5.6%、11.1%和30.1%，胎兒染色體異常率隨NT厚度增加顯著增加，與文獻相符。MAYA等[21]分析了1 588例NT增厚胎兒CMA結果，其中胎兒NT厚度≤2.9 mm、 3.0～3.4 mm和≥3.5 mm的致病性CNVs檢出率分別為1.7%、6.5%和13.8%，認為NT增厚胎兒行CMA檢測的cut-off值可定在3.0～3.4 mm。本研究中當NT≥3.5 mm時，應用SNP array技術在NT增厚胎兒中共檢出31例異常CNVs，與單純核型分析檢出24例相比，可將遺傳學病因的檢出率提高6.8%，兩者差異有統計學意義（P＜0.05），而NT厚度為3.0～ 3.4 mm時，檢出率僅提高3.2%，差異無統計學意義。因此筆者認為，SNP array技術對于NT≥3.5 mm胎兒有更高的檢測價值。

綜上所述，NT增厚與染色體異常相關，隨著NT厚度增加，胎兒染色體異常率顯著增加。當NT≥ 3.5 mm時，聯合應用核型分析技術和SNP array技術對NT增厚的胎兒進行產前遺傳學診斷，可將遺傳學病因的檢出率提高6.8%。