26份水稻材料白葉枯病和稻飛虱病抗性基因檢測與分析

宗凱 盛旋 呂俠影 程瀟 李云飛 孫娟娟 李克娟 余曉峰 姚劍

摘要?對26份水稻材料進行抗病基因檢測，包括8個白葉枯病抗性基因（Xa1、 xa5、 Xa7、xa13、 Xa21、 Xa23、 Xa26、 Xa27）和2個稻飛虱病抗性基因（Bph14、 Bph15）。其中23份水稻材料中含有Xa1基因材料20份，含xa5基因材料20份，含Xa7基因材料23份，含xa13基因材料12份，含 Xa21基因材料9份，含 Xa23基因材料23份，其中抗性4份，感性19份，含Xa26基因材料23份，含Xa27基因材料21份，其中抗性5份，感性16份。另有3份材料進行稻飛虱病抗性基因Bph14、Bph15檢測，檢測結果表明這3份材料均含有Bph14、Bph15基因。選取13個已報道的基因標記或連鎖標記檢測26份雜交稻材料，初步確定了其抗白葉枯病和抗稻飛虱病等位基因分布和利用情況，為水稻基礎材料的篩選、親本材料的選擇及育種應用提供了良好的參考。

關鍵詞?水稻品系;抗性基因;白葉枯病;鑒定

中圖分類號?S435.11?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）01-0088-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.023

Abstract?Twenty-six rice varieties were tested for disease resistance genes， including eight bacterial blight resistance genes （Xa1， xa5， Xa7， xa13， Xa21， Xa23， Xa26， Xa27） and two rice planthopper disease resistance genes （Bph14， Bph15）. Among them， 23 rice materials contained 20 Xa1 genetic materials， 20 xa5 genetic materials， 23 Xa7 genetic materials， 12 xa13 genetic materials， 9 Xa21 genetic materials， 23 Xa23 genetic materials， including 4 resistance， 19 susceptibility， 23 Xa26 genetic materials and 21 Xa27 genetic materials， including 5 resistance and 16 susceptibility. Three other materials were tested for Bph14 and Bph15 genes of rice planthopper disease resistance. The results showed that all the three materials contained Bph14 and Bph15 genes. The distribution and utilization of alleles for resistance to bacterial blight and rice planthopper disease in 26 hybrid rice materials were preliminarily determined by screening 13 reported gene markers or linkage markers， which provided a good reference for screening basic rice materials， selection of parent materials and breeding application.

Key words?Rice strains;Resistance gene;Bacterial blight;Identification

水稻是我國重要的主糧之一，而白葉枯病和稻飛虱病是水稻生產中重要的，也是常見的病蟲害[1-2]，針對這2種病蟲害的抗性基因定位和克隆一直備受關注。目前已有超過26個白葉枯病抗性基因和20個褐稻飛虱病抗性基因被定位，其中7個白葉枯病抗性基因和1個褐稻飛虱病抗性基因已經被克隆，與此同時，與這些抗性基因緊密連鎖或者共分離的分子標記被開發出來，利用這些已鑒定的分子標記可以快速準確地篩選和鑒定出水稻材料中所含的抗性基因類型，輔助水稻育種親本材料的篩選，顯著加速育種過程。該研究篩選8個白葉枯病抗性基因（Xa1、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23、Xa26、Xa27）和2個稻飛虱病抗性基因（Bph14、Bph15）的分子標記，對26份雜交稻親本材料所含抗性基因以及其等位基因分布情況進行鑒定和分析，以期為水稻后續育種提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

水稻材料由安徽袁氏農業科技有限公司提供，共計26個水稻品系種子（美1、孟R、9311、578、513、小提供灰21、OM6162、繁殖1、繁殖2、馬粘、玉香、AD2168、NGGYEN、巴馬、華素、泰早、孟紅、鎮稻18、豐兩優秀1號、豐兩優秀6號、豐兩優秀4號、鎮稻19、普通野生稻、W644、S234、234）。

1.2?儀器與設備

PCR儀，美國ABI公司;DNA/RNA分析系統，德國QIAGEN公司。

1.3?方法

鑒定白葉枯抗性基因Xa1、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23、Xa26、Xa27這8個基因所用分子標記來自文獻[3，5]（表1）。鑒定2個稻飛虱病抗性基因Bph14、Bph15所用分子標記來自文獻[6-7]（表2）。種子DNA提取采用磁珠全自動核酸提取儀。

2?結果與分析

2.1?23份水稻材料白葉枯病抗性基因檢測結果

Xa1是已克隆的NBS-LRR類白葉枯病抗性基因，在NCBI中基因ID為AB002266.1，采用Xa1-F和Xa1-R這對連鎖標記對23個水稻品系進行檢測，結果見圖1（A）。除9號、10號、13號未檢測到抗性基因外，其他均檢出Xa1抗性基因。其中1號擴出2條目的帶，一條與抗性等位基因目的帶在相同位置，另一條則比抗性等位基因目的帶大約100 bp。11號、12號、19～21號、23號均存在2條目的帶，推測除檢出與抗性對照等位基因的目的帶外還存在另一等位基因。

xa5位于5號染色體，cDNA全長906 bp，包含3個外顯子，編碼一個由106個氨基酸組成的蛋白產物，xa5是一個隱性抗病基因，其基因結構與其他典型抗病基因的結構都不一樣。xa5序列在抗病和感病品種中有2個堿基的差異（GTC→GAG），導致第39位氨基酸的改變[纈氨酸（V）變成谷氨酸（E）]。xa5所用的分子標記檢出除2～4號未擴出，其他均擴出，見圖1（B）。經測序1號、5～23號在第39位編碼的是纈氨酸（V），為抗性品系。

1～23份水稻材料均擴出抗性基因Xa7，見圖1（C），11～12號樣品產物條帶較淡，5～7號擴增產物大小與其他不一致，對5～7號樣品擴增產物進行測序，發現5號和7號樣品產物測序比對后基因序列基本一致，6號在2個位置與5號、7號存在差異，在接近5端6號多1個G，在接近3端6號與5號、7號存在微略差異：“CCCCGTCCGGCATCTA” →“GCCCGCCCGGCAT”。

xa13是1個隱性抗白葉枯病基因，cDNA 全長1 516 bp，包含5個外顯子，編碼1個由307個氨基酸組成、含有跨膜結構域的蛋白產物。所采用的分子標記能通過擴增目的帶片段長度區分抗與感系品種，經檢測6號、9～16號、19～20號均為感系品種。其他樣品未擴出目的基因，見圖1（D）。

Xa21編碼產物是1個由1 025個氨基酸組成的類受體蛋白激酶，采用Xa21-F和Xa21-R分子標記擴增Xa21抗性基因產物長度為1 399 bp，感性基因擴增產物長度為1 274 bp，經基因測序判斷，樣品1號、3號、5～6號、8～9號、13號、17號、22號均檢出感性等位基因，見圖1（E）。

Xa23基因來自普通野生稻的抗白葉枯病基因，具有廣譜抗性。Xa23-P23F 和Xa23-P23R這對分子標記擴增抗性基因片段為474 bp，感性基因為600 bp，通過電泳結果可以判斷8號、14號、22～23號檢出抗性基因，其他樣品含感性基因，見圖1（F）。

Xa26基因所用分子標記對23個品系水稻進行檢測均擴出目的帶，見圖1（G），部分品系存在多條目的帶，部分條帶存在深淺差異，挑取部分樣品進行測序（1～6號、9～10號、18號、22號），經比對測序序列同源性在95%以上。

Xa27cDNA 全長2 361 bp，僅含有1個外顯子，編碼1個由113個氨基酸組成的亞基，Xa27的編碼序列在感病品種IR24 和抗病品種IRBB27 中完全一樣，只是啟動子區有2處差別，與IRBB27 相比，IR24 中的Xa27啟動子在ATG 上游1.4 kb 左右多出一段10 bp 的序列，另外在TA 框前多出25 bp 的序列，Xa27所用分子標記正好設計在這個位置，可以通過擴增片段差異區別抗、感性基因，1號、6號、14號、17～18號檢出抗性等位基因，3～5號、7～13號、15～16號、19～21號、23號檢出感性等位基因，見圖1（H）。

2.2?3份水稻材料稻飛虱抗性基因檢測結果

W644、S234、234這3份樣品經Bph14和Bph15這5對分子標記檢測，均擴出目標抗性基因（圖2），W644與S234、234在Bph15-F和Bph15-R這對分子標記擴增下存在多態性。

從表3可以看出，23份水稻材料中含Xa1和xa5抗性基因的各有20份，占比87.0%;含有Xa7和Xa26基因的均為23份，占比100%;含xa13基因12份，占比52.2%，均為感性基因;含Xa21基因9份，占比39.1%，均為感性基因;含有Xa23抗性基因4份，感性基因19份，分別占比17.4%和82.6%;含有Xa27抗性基因5份，感性基因16份，分別占比21.7%和69.6%。另外3份水稻均含有抗稻飛虱Bph14和Bph15基因。

從表3還可以看出，大部分水稻材料均含有2個以上的白葉枯病抗性基因，其中美1、小提供灰21、繁殖1、巴馬、孟紅、鎮稻18、鎮稻19、普通野生稻等含有5個以上白葉枯病抗性基因（Xa1、xa5、Xa7、Xa23、Xa26和Xa27），513、OM6162、玉香、AD2168、華素、泰早、豐兩優秀1號、豐兩優秀6號、豐兩優秀4號等含有4個白葉枯病抗性基因，孟R、9311、578、繁殖2、馬粘、NGGYEN含有3個白葉枯病抗性基因。

3?結論

分子標記是一種非常方便、簡單、準確有效的篩選抗病基因的方法，對于現代育種意義重大[8-9]，它可以縮短育種周期，篩選育種親本和后代，給水稻育種提供明確的育種方向和指導。該研究選取多個白葉枯病抗性基因和稻飛虱抗性基因特異性分子標記，對26份水稻材料中含有抗性基因類型進行檢測，為后續水稻常規育種中親本選擇、育種組合配置以及不同抗性基因聚合等奠定了基礎[10-11]。

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