谷子CDPK基因家族全基因組序列鑒定及進化分析

魏萌涵 宋慧 王素英 劉海萍 邢璐 解慧芳 王淑君 劉金榮

摘要?鈣依賴蛋白激酶（CDPK）是一類主要的鈣信號感受器，對鈣信號的感知和解碼起重要調控作用。為揭示CDPK在谷子生長發育和抗逆防御機制中的作用，該研究利用生物信息學的方法，從谷子基因組中鑒定出28個SiCPKs基因，對這些家族成員的基因結構、系統進化、染色體定位、基因復制及其所編碼蛋白的理化性質進行系統生物信息學分析。結果表明，該研究鑒定出的28個SiCPKs基因所編碼的氨基酸長度為51.82～68.32 kD，等電點為4.97～9.01，氨基酸序列絕大多數含有4個EF-Hand功能域且高度保守;基因結構預測結果表明，大多數SiCPK基因均含有6～8個外顯子，染色體定位結果表明，28個SiCPKs基因分別定位在8條染色體上，其中9號染色體上最多（6個），4號染色體上沒有;為了進一步分析谷子和其他物種的同源進化關系，構建了谷子與擬南芥、水稻、萊茵衣藻、小立碗蘚的CDPK進化樹，發現萊茵衣藻與小立碗蘚單獨聚類，谷子與水稻的親緣關系比擬南芥近;共線性分析表明，谷子與水稻基因間存在串聯重復和片段重復，它們是谷子CDPK家族成員擴張的主要動力。綜上所述，谷子28個CDPK基因在進化上分為4個亞家族，基因結構的復雜程度與進化樹聚類存在聯系，串聯復制是基因家族成員擴增的進化途徑之一。

關鍵詞?CDPK基因;基因鑒定;系統進化;谷子;生物信息學

中圖分類號?S188?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）01-0083-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.022

Abstract?As one of the Ca2+ sensors，calcium-dependent protein kinase （CDPK） plays vital roles in Ca2+ signal perception and decoding.A genome-wide analysis of SiCPK genes was performed in this study.Twenty-eight SiCPK genes were identified to analyze the properties，gene structure，chromosomal location，system evolution，and the expression of these genes.As the results indicate，the molecular weight was 51.82-68.32 kD，the isoelectric point was 4.97-9.01.Most SiCPK protein contains four EF-Hand functional domains and highly conservative.Gene structure analysis indicated that most of these SiCPK genes share a similar intron-exon structure （6-8 exons）.The SiCPK genes were found to be unevenly distributed on chromosomes.For instance，6 SiCPK genes were found on chromosome 9，while none were found on chromosomes 4.In order to further analyze the homologous evolution relationship of Setaria italica and other species，the evolutionary tree was built.The result showed that Chlamydomonas reinhartii and Physcomitrella patens were separately clustered，CDPK in millet （Setaria italic） and relative rice were clustered together.Collinearity analysis showed that tandem duplication and segmental duplication existed in millet and rice CDPK genes，which caused genetic expansion.In conclusion，the twenty-eight SiCPK genes were clustered 4 subgroups，the complexity of the genetic structure and the evolutionary tree had a relationship，and the family members were recruited by chromosome replication.

Key words?CDPK;Gene identification;Systematic evolution;Setaria italic;Bioinformatics

植物在適應各種環境條件的過程中，形成了復雜的網絡信號通路，Ca2+作為胞內第二信使在信號轉導通路中起著重要的作用[1]。當植物受到外界刺激時，胞質中Ca2+濃度變化產生鈣信號，鈣信號的再次傳遞需要經Ca2+結合蛋白才能完成。在植物中已經鑒定出四類鈣傳感/綁定蛋白，它們是鈣調蛋白（CaM）、類鈣調蛋白（CaML）、類鈣調磷酸酶B類蛋白（CBL）和鈣依賴蛋白激酶（CDPK）[2-3]，但是CaM、CaML、CBL由于缺少效應區，只能作為Ca2+感應器傳遞鈣信號，通過與其他靶蛋白的結合來調節其活性[4];而CDPK含有與Ca2+結合的功能結構域，因此除了具有Ca2+感應器的功能，還具有效應器的功能，通過改變其自抑制區的構象而改變其活性[5]。鈣依賴蛋白激酶是植物和原生生物所獨有的一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，是到目前為止研究最為普遍的Ca2+傳感器之一[6]。在不同植物研究中發現，CDPK可響應外界不同刺激，在植物的抗逆脅迫反應中起重要的調控作用[7-9]。谷子是一種古老的抗旱耐瘠作物，具有很強的抗逆性。早在2012年，谷子全基因組序列已經公布[10]，作物中關于CDPK基因家族的研究主要集中在水稻、玉米、小麥中，而在谷子中鮮見報道。該研究通過對谷子全基因組數據庫的搜索，篩選出CDPK基因家族成員，通過構建系統進化樹、染色體定位、基因組比較等生物信息學方法，分析CDPK基因的進化關系，為進一步研究SiCPK基因家族功能提供依據。

1?材料與方法

1.1?谷子CDPK家族蛋白序列的獲得及理化性質分析

從Phytozome 11 （https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Sitalica）中下載最新的谷子全基因組注釋序列，根據已報道的谷子SiCDPK1蛋白序列[11]，以及已公布的擬南芥CDPK家族基因的蛋白序列進行本地Blast比對，E-value值為le-5，輸出最優比對結果，根據比對長度（>400 aa）和相似度（>40% ）篩選谷子候選CDPK 基因。在Pfam （http：//pfam.sanger.ac.uk/）和SMART （http：//smart.embl-heidelberg.de/）網站上對初步獲得的基因做進一步鑒定。利用ExPASy （http：//expasy.org/）在線工具進行氨基酸理化性質的分析，包括等電點、分子量、N-末端豆蔻酰化及糖基化位點等。

1.2?多序列比對和系統發育樹的構建

利用MEGA5.0軟件對該研究鑒定的基因家族的蛋白序列與擬南芥 （Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reintmrdtii）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）等各個物種基因組數據庫中已收錄的這些基因家族的序列進行同源性分析，利用鄰接算法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，參數設置如下：進化樹構建方法p-distance，測試方法Bootstrap，重復數1 000。

1.3?基因結構鑒定?在Phytozome11數據庫中可以找到每個基因相應的結構信息，包括外顯子、內含子、上下游非編碼區序列，將這些信息進行整理，在GSDS （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）網站進行在線分析，繪制基因結構圖[12]。

1.4?染色體定位和基因復制

根據Phytozome數據庫上基因注釋信息，獲取SiCPK基因家族染色體位置，利用Mapinspector軟件進行染色體定位作圖。在同一個進化樹組內，在100 kb基因組窗口中同時出現的2個或2個以上基因被稱為串聯復制。

2?結果與分析

2.1?谷子CDPK基因家族成員理化性質分析

通過對谷子基因組數據庫的搜索，并利用Pfam和SMART進一步分析，最終確定28個CDPK基因，并對其進行命名。通過對CDPK基因所編碼的蛋白質結構進行分析，發現均含有EF-hand手型特征結構域，大多數CDPK含有4個EF-hand結構，只有少數含有2～3個（SiCPK22、SiCPK23）（表1），而且EF-hand 功能域之間的距離非常恒定，且高度保守。通過ExPASy工具，對谷子CDPK基因進行了分子量、等電點、豆蔻酰化及糖基化位點等理化性質分析，發現SiCPK家族基因的分子量為51.82（SiCPK12）～68.32 kD（SiCPK10）、氨基酸長度為457（SiCPK12）～618 aa（SiCPK10）、核苷酸長度為1 374（SiCPK12）～1 857 kb（SiCPK10），其所編碼蛋白的等電點在4.97（SiCPK23）～9.01（SiCPK28）變化，且酸性蛋白居多，第Ⅰ和Ⅱ亞家族蛋白的等電點均小于7，第Ⅲ亞家族只有少數蛋白的等電點大于7，而Ⅳ亞家族的等電點均大于7（表1）。通過對CDPK基因家族蛋白翻譯后修飾的分析，發現大多數蛋白會發生翻譯后N末端豆蔻酰化和糖基化修飾（表1），在蛋白行使功能上起著重要作用。

2.2?進化樹與基因結構分析

對谷子CDPK家族基因的基因結構和進化樹分析，有助于進一步了解谷子CDPK基因進化關系。從進化樹中可以看出（圖1左側），28個SiCPKs被聚類為4個亞家族，根據擬南芥的研究結果，將這4個亞家族命名為Group Ⅰ～Ⅳ，其中第三亞家族又被分為兩部分。從進化樹中可以看出，28個SiCPK基因形成了12個旁系同源基因對，它們的基因步長值（bootstrap values）均高于89。通過對其家族成員的基因結構進行分析（圖1右側），發現Group Ⅰ家族基因的外顯子個數比較恒定，主要為7（除了SiCPK2和SiCPK10分別為1個和6個）;Group Ⅱ家族基因的外顯子個數為6～8;Group Ⅲ家族基因的外顯子個數為7～8;Group Ⅳ家族基因的外顯子個數均為12。從圖1可以看出，同一亞家族或相鄰亞家族之間的基因有相似的基因結構。

2.3?染色體定位與共線性分析

為了解谷子CDPK家族基因的組織形式，繪制了其染色體定位圖（圖2）。28個CDPK基因分別定位在谷子的8條染色體上。其中9號染色體上包含的基因數量最多，含有6個基因家族成員，8號染色體上未見有基因定位。12對旁系同源基因中的11對（SiCPK5/SiCPK25、SiCPK10/SiCPK24、SiCPK20/SiCPK22、SiCPK1/SiCPK19、SiCPK11/SiCPK16、SiCPK3/SiCPK4、SiCPK6/SiCPK21、SiCPK8/SiCPK18、SiCPK7/SiCPK27、SiCPK12/SiCPK15、SiCPK9/SiCPK17）被定位在不同的染色體上，形成片段重復。結果表明，片段重復和串聯復制導致了谷子CDPK基因家族的擴張。

2.4?系統進化分析及功能預測

為了進一步分析CDPK基因在不同物種中的進化情況，將谷子與擬南芥、水稻、小立碗蘚、萊茵衣藻等物種的蛋白質序列構建進化樹，進行系統進化分析。從圖3可以看出，由萊茵衣藻、小立碗蘚為代表的低等植物形成一個外群體，同時單子葉植物和雙子葉植物也分別單獨聚類，同是單子葉植物的水稻和谷子在進化樹上的親緣關系比雙子葉植物擬南芥更近。從表2可以看出，CDPK各亞家族的分化發生在單細胞植物衣藻之后，小立碗蘚之前。萊茵衣藻作為最簡單的單細胞藻類，其11個CDPK基因均被聚類在第四亞家族，而小立碗蘚及較高等植物的CDPK基因被聚類為4個亞組，且第四亞家族的基因分布最少。推測在基因復雜的復制過程中可能發生了基因丟失或基因轉換事件。

由圖3可知，幾乎每個谷子CDPK家族成員都與水稻存在同源對關系，在該研究中對水稻CDPK基因的功能進行分析，為以后研究谷子CDPK基因功能奠定基礎。

3?討論

鈣依賴蛋白激酶（CDPK）基因家族是鈣調蛋白激酶的第三家族[13]，它在胞內鈣信號的級聯放大及傳遞過程中起著重要作用。通過對CDPK基因家族成員的理化性質、基因結構、翻譯后修飾位點、染色體定位、進化關系等方面的研究，我們對CDPK家族有了更深入的了解，為以后進一步了解其在干旱方面的作用奠定了基礎。

該研究共鑒定出28個SiCPKs基因，其理化性質分析結果表明，谷子CDPK家族基因的理化性質與其他物種的相似，部分CDPK成員N末端存在與膜定位相關的豆蔻酰化和十六烷酰化所需的保守序列MGXXC（S/Q）XXT 位點，推測這些結構可能在參與蛋白質與質膜的可逆結合或蛋白間相互作用過程中起重要調控作用。

系統進化樹的構建有助于分析基因之間的起源關系，預測基因功能。根據聚類分析，SiCPK基因家族可以分為4個亞家族（Group Ⅰ、Group Ⅱ、Group Ⅲ 和Group Ⅳ），與其他物種上的CDPK基因家族相似[14-15]。將擬南芥、水稻、小立碗蘚和蘋果的同源基因共同構建進化樹分析發現，谷子CDPK基因的數量與擬南芥、水稻相近，但各亞家族所含成員的數量在這3個物種中有所區別，在谷子和水稻中，第一亞家族所含的數量最多，但在擬南芥中，第二亞家族所含的數量最多，且谷子和擬南芥的成員趨向于分開聚類，暗示這些分組在單子葉植物與雙子葉植物分化前就已存在;此外，還發現由萊茵衣藻的9個CDPK基因被單獨聚類，且均分布于Group IV，而小立碗蘚的CDPK基因被聚類為4個亞家族，暗示在苔蘚類和陸生植物分化前CDPK家族基因就已被分為4 類的假設[16]。盡管植物CDPK基因由同一個祖先進化而來，但在進化過程中它們經歷了不同的分化模式，最終形成不同的物種。進化樹中聚類關系越近，說明其功能類似的可能性越大，在該研究中發現，谷子CDPK基因幾乎均與水稻存在同源基因，這也為研究谷子CDPK家族基因的功能提供了基礎。谷子CDPK基因結構較為復雜，外顯子數目為6～12（除SiCPK2有1個外顯子），復雜的基因結構可能會導致基因結構不穩定，且復制時易產生可變剪切。植物種屬的CDPK可能來自于蛋白激酶和CaM基因的融合[17]，因此，谷子CDPK家族基因的結構差異可能與蛋白激酶或CaM序列的差異有關。

基因復制在生物體進化過程中起著重要作用，包括串聯復制、局部復制和整個基因組復制[18]。谷子的基因組測序結果表明，谷子的2號和9號染色體分別由水稻的7號和9號、3號和10號染色體融合而成，并且研究發現，谷子獨立分化出來之后又發生了一次特異性染色體融合事件，即谷子的3號染色體是由水稻的5號和12號染色體或高粱的8號和9號染色體融合而成。谷子和水稻大約在5 000萬年前（50 Mya）開始分化，二者分化之后的基因組結構仍存在明顯的共線性[10]。在該研究中發現，谷子的12對旁系同源基因中有11對旁系同源基因位于染色體復制產生的重復片段內，因而可能起源于片段復制事件，說明片段復制也是谷子CDPK基因家族擴增的一個主要原因。基因的染色體定位是片段重復和串聯重復共同作用的結果，對基因家族擴展具有重要的推動作用。

目前，對植物CDPK的研究主要集中在模式植物及豆科植物上，谷子CDPK家族基因的生物信息學研究鮮有深入報道。該研究以谷子全基因組序列為背景，完成了28個SiCPK家族基因的生物信息學分析，也為進一步鑒定其功能奠定了基礎。隨著分子生物學和基因工程技術的不斷發展，谷子CDPK基因如何響應外界刺激、參與抗逆反應信號轉導等都將成為日后研究的重要方向。

參考文獻

[1]TREWAVAS A J，MALH R.Ca2+ signalling in plant cells：The big network！[J].Current opinion in plant biology，1998，1（5）：428-433.

[2]MCCORMACK E，BRAAM J.Calmodulins and related potential calcium sensors of Arabidopsis[J].New phytologist，2003，159（3）：585-598.

[3]KOLUKISAOGLU ，WEINL S，BLAZEVIC D，et al.Calcium sensors and their interacting protein kinases：Genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks[J].Plant physiology，2004，134（1）：43-58.

[4]LUAN S，KUDLA J，RODRIGUEZ-CONCEPCION M，et al.Calmodulins and calcineurin B-like proteins：Calcium sensors for specific signal response coupling in plants[J].The plant cell online，2002，14（S1）：S389-S400.

[5]HRABAK E M，CHAN C W，GRIBSKOV M，et al.The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases[J].Plant physiology，2003，132（2）：666-680.

[6]HARPER J F，HARMON A.Plants，symbiosis and parasites：A calcium signalling connection[J].Nature reviews molecular cell biology，2005，6（7）：555-566.

[7]LUDWIG A A，ROMEIS T，JONES J D G.CDPK-mediated signalling pathways：Specificity and cross-talk[J].Journal of experimental botany，2003，55（395）：181-188.

[8]LI A L，WANG X，LESEBERG C H，et al.Biotic and abiotic stress responses through calcium-dependent protein kinase （CDPK） signaling in wheat （Triticum aestivum L.）[J].Plant signaling & behavior，2008，3（9）：654-656.

[9]ASANO T，HAYASHI N，KIKUCHI S，et al.CDPK-mediated abiotic stress signaling[J].Plant signaling & behavior，2012，7（7）：817-821.

[10]ZHANG G Y，LIU X，QUAN Z W，et al.Genome sequence of foxtail millet （Setaria italica） provides insights into grass evolution and biofuel potential[J].Nature biotechnology，2012，30（6）：549-554.

[11]余琴鴦，尹恒，安利佳，等.谷子逆境應答相關的鈣依賴蛋白激酶基因SiCDPK1的克隆與表達[J].作物學報，2014，40（9）：1531-1539.

[12]GUO A Y，ZHU Q H，CHEN X，et al.GSDS：A gene structure display server[J].Hereditas （Beijing），2007，29（8）：1023-1026.

[13]倪天華，魏幼璋.鈣依賴型蛋白激酶（CDPKs）在植物中的生理功能[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2002，30（6）：241-246.

[14]LIU W，LI W，HE Q L，et al.Genome-wide survey and expression analysis of calcium-dependent protein kinase in Gossypium raimondii[J].PLoS One，2014，9（6）：1-11.

[15]MA P D，LIU J Y，YANG X D，et al.Genome-wide identification of the maize calcium-dependent protein kinase gene family[J].Applied biochemistry and biotechnology，2013，169（7）：2111-2125.

[16]CHEN F，FASOLI M，TORNIELLI G B，et al.The evolutionary history and diverse physiological roles of the grapevine calcium-dependent protein kinase gene family[J].PLoS One，2013，8（12）：1-11.

[17]ZHANG X S，CHOI J H.Molecular evolution of calmodulin-like domain protein kinases （CDPKs） in plants and protists[J].Journal of molecular evolution，2001，53（3）：214-224.

[18]XU G，GUO C，SHAN H，et al.Divergence of duplicate genes in exon-intron structure[J].Proceedings of the national academy of sciences，2012，109（4）：1187-1192.