免疫評分在肝癌患者中的預后研究

張浩楠，張林枝，高煒，徐彥，楊雪玲，于海鵬，邢文閣，司同國

1.天津市第一中心醫院放射科，天津影像醫學研究所，天津 300192；2.天津醫科大學腫瘤醫院介入治療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津 300060；3.解放軍總醫院第五醫學中心介入科，北京100039

傳統判斷腫瘤預后常根據外科手術切除標本行病理學檢查，采用國際通用的TNM分期，其中T分期指原發腫瘤的大小及數目，N分期指局部或遠處淋巴結轉移，M分期指遠處轉移。當前關于腫瘤的研究已邁進精準檢測與免疫治療時代。腫瘤的發生發展是涉及多基因、多階段的序貫過程，且與腫瘤微環境內免疫細胞、基質細胞與相關分泌的細胞因子、炎性因子等作用密切相關。據報道，即使同處TNM早期的患者，經手術達到R0切除，沒有任何遠端轉移，其術后的生存周期卻可以明顯不同[1,2]，提示TNM分期雖在一定程度上反應患者的預后，但因未能對腫瘤中心（tumor center，TC）與侵襲性周緣（invasive margin，IM）免疫細胞浸潤的狀態作出評估，對免疫治療有效患者的類群揭示意義不足。

原發性肝癌的腫瘤異質性很強，即使適合外科切除的術后早期復發率仍然高達52.3%，大部分患者因早期復發及轉移，預后較差，僅有極少部分患者可以獲得較長的生存。原因在于既往研究僅關注腫瘤本身的生物學行為及狀態，但對腫瘤生長的土壤-腫瘤微環境的免疫學狀態未予重視。因此明確患者預后差異的不同免疫學背景是極為重要的。有學者提出運用免疫評分（immunoscore）作為TNM分期的輔助評分系統（TNM-I）對結腸癌患者進行生存預測得到較好的預測價值，然而有關免疫評分的報道目前集中于結腸癌，還需要在更多類型實體腫瘤中得到驗證[3,4]。已有報道提及疾病進程中CD8+T對于腫瘤細胞殺傷的重要性，這其中以來自外周血的數據居多，肝癌組織局部的免疫狀態與預后關系研究較少[5,6]。肝癌中CD3+T、CD8+T細胞浸潤密度和患者的生存預后報道較少，也并沒有統一的定論。本文回顧性收集61例病理學確診為原發性肝癌的手術蠟塊，通過免疫組化進行CD3+T、CD8+T細胞染色，分析PD-L1、免疫評分與臨床病理特征及預后之間的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2015年12月天津醫科大學腫瘤醫院收治的住院患者，經手術切除的原發性肝癌標本61例。所有病例術前未接受放化療及新輔助治療，術后大標本的病理診斷為原發性肝細胞肝癌，另外設置15例癌旁組織為對照。其中男性53例，女性8例，男女比例約為6.6：1。年齡36～73歲，中位年齡（55.7±8.4）歲。單發腫瘤43例（70.5%），多發腫瘤18例（29.5%）。根據AJCC/UICC 2010年第7版TNM分期標準[7]，Ⅰ期35例（57.4%）、Ⅱ期14例（23%）、Ⅲ期12例（19.6%）。按照組織學分級標準[8]，中分化38例（62.3%）、低分化23例（37.7%）。腫瘤大小≤2 cm者3例（4.9%）、2～5 cm者29例（47.5%）、＞5 cm者29例（47.5%）。有脈管瘤栓者41例（67.2%）、無脈管瘤栓者20例（23.8%）。所有病例臨床資料完整且隨訪時間超過5年，末次隨訪日期為2018年5月；隨訪期間發生遠處轉移19例（31.1%）、無遠處轉移42例（68.9%）。上述肝癌組織標本由外科手術獲取，且每位患者術前已知曉并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 記錄臨床特征 所有61例病例以電話、門診影像學復查的方式進行隨訪。收集臨床病理特征信息諸如：年齡、性別、腫瘤大小，單發或多發腫瘤、術前AFP、T分期、總分期、腫瘤分化程度、肝炎病史、肝硬化病史、有無發生肝內復發及遠處轉移并記錄轉移位置、有無脈管侵犯、無瘤生存期、總生存期（表1）。

表1 肝癌隊列臨床特征%（n）Tab.1 Clinical characteristics of patients with hepatocellular carcinoma%（n）

1.2.2 實驗方法采用免疫組織化學三步法進行染色。將標本蠟塊制備成5μm切片，經脫蠟梯度酒精復水后，置于pH 9.0的EDTA緩沖液中，用高壓鍋加熱至噴氣后開始計時150 s，滴加鼠抗人CD3、CD8單克隆抗體工作液（購自北京中杉生物技術有限公司），兔抗人PD-L1抗體（克隆號E1L3N，購自cell signaling technology，按1：400稀釋），4℃冰箱孵育過夜，次日室溫下與二抗結合反應30 min，洗片后滴加三抗經DAB顯色及蘇木精復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明后封片，鏡下拍照。

1.2.3 免疫組化結果判讀 為保證結果的準確性和客觀性，切片均由2名資深病理科醫師采用雙盲法獨立評估。PD-L1陽性表達判斷用半定量積分法，結合染色強度和陽性細胞百分比來評定，細胞質或細胞膜出現黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。先在低倍鏡下觀察完整切片，選取具有代表性視野后分別在腫瘤細胞及腫瘤間質隨機選擇5個高倍視野（×400），染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞密度：陽性細胞數≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。兩項得分乘積≥3分為陽性表達。CD3+T、CD8+T陽性結果判讀采用細胞計數法。先用低倍鏡觀察整張切片，分別尋找具有代表性的腫瘤中心及侵襲性邊緣陽性淋巴細胞密度較高處，在其中隨機選擇5個高倍視野，每個視野計數CD3+T、CD8+T陽性淋巴細胞數，并求其在不同區域內的平均值作為該例CD3+T、CD8+T淋巴細胞數。以所有切片CD3+T、CD8+T陽性細胞數的均數為基準，大于該值即為陽性表達記為1分，低于該值即為陰性表達記為0分。將兩個區域內的免疫浸潤細胞分別評分并計入總分，可以得到I0、I1、I2、I3、I4 5個不同免疫評分值。I0～I2定義為低免疫評分，I3～I4為高免疫評分。

1.3 統計學處理

用SPSS22.0軟件進行統計分析，計量資料呈正態分布或近似正態分布，用均數±標準差表示。性資料不同組間比較采用卡方檢驗及Fisher精確概率法，生存率的組間比較采用Kaplan-Meier生存曲線法及Log-rank檢驗，以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CD3+T、CD8+T分布與表達

CD3+T、CD8+T主要定位于腫瘤侵襲性邊緣的間質淋巴細胞的細胞質和細胞膜（圖1，2）。CD3+T、CD8+T淋巴細胞的分布模式分為3種：⑴免疫炎型：腫瘤中心與侵襲性邊緣均可見大量免疫淋巴細胞浸潤，該分布模式的免疫評分為I3～I4；⑵免疫豁免型：CD3+T、CD8+T淋巴細胞大量浸潤于侵襲性邊緣的周圍而難以進入腫瘤中心，其免疫評分為I1～I2；⑶免疫荒漠型：腫瘤中心與侵襲性邊緣幾乎不見免疫淋巴細胞浸潤，該模式的免疫評分為I0。本隊列中免疫評分較高的表達率為26.2%（16/61），免疫評分較低的表達率為73.8%（45/61）。

圖1 免疫炎型淋巴細胞浸潤A、B：不同放大背景中觀察腫瘤中心可見大量淋巴細胞浸潤C、D：不同放大背景中觀察腫瘤侵襲性周緣可見大量淋巴細胞浸潤Fig.1 Representative images of tumorinfiltrating lymphocytes(TILs)in immune-hot patternA、B:Observation of a large number of TILs in the tumor center in different magnification；C and D:Observation of a large number of TILs in the invasive margin in different magnification

將免疫評分與患者臨床特征進行統計學分析，免疫評分與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、脈管癌栓等臨床因素無相關性（P＞0.05）。免疫評分與血清AFP增高（P＜0.05）及肝內復發（P＜0.05）具有相關性。免疫評分較低的患者更易出現早期復發，預后更差，詳見表2。

表2 免疫評分與HCC患者臨床特征分析%（n）Tab.2 Clinical characteristics and immunoscore analysis of HCC%（n）

2.3 免疫評分與患者生存之間的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示，免疫評分較高患者（I3～I4）生存期顯著高于免疫評分較低的患者（I0～I2），χ2=11.39，P＜0.01。免疫評分較高患者（I3～I4）無復發生存期同樣顯著高于免疫評分較低的患者（I0～I2），χ2=14.78，P＜0.01，見圖3。

2.4 PD-L1在肝癌及癌旁的表達

為保證實驗染色的準確性，設置胎盤組織陽性對照及癌旁陰性對照同批進行免疫組化實驗（圖4）。PD-L1陽性染色細胞主要定位于腫瘤中心的細胞質和細胞膜（圖5）。肝癌組織中PD-L1蛋白的陽性表達率為44.3%（27/61），其癌旁組織很少表達，差異具有統計學意義（χ2=7.313，P＜0.01，表3）。

2.5 PD-L1表達與患者生存之間的關系

Kaplan-Meier生存曲線顯示，PD-L1陽性患者的總生存期低于PD-L1陰性患者（χ2=5.598，P＜0.05）。PD-L1陽性患者無復發生存期顯著低于PD-L1陰性患者（χ2=10.90，P＜0.01），見圖6。

2.6 PD-L1的表達與免疫評分的相關性

將免疫評分與PD-L1表達統計學分析相關性，PD-L1表達較高的患者免疫評分較低，而免疫評分較高的患者中PD-L1表達量較低，呈現負相關，具有顯著的統計學意義，χ2=12.703，P＜0.01,見表4。

3 討論

目前有很多預后評價方式用來對肝癌患者進行分層管理與治療，其中包括TNM分期，BCLC分期，ECOG評分等。正如先前的研究報道血清AFP、血管浸潤、腫瘤分期均可預測患者的復發與預后，然而以上評分系統及血清標志物提供患者有限的預后信息[9～11]。它們未能揭示肝癌中心及其所處微環境的免疫學狀態，對于腫瘤免疫異質性的解釋也不充足，已落后于免疫治療的新時代。

圖2 免疫豁免型與免疫荒漠淋巴細胞浸潤A、B：免疫豁免型,在不同放大背景中腫瘤中心無免疫細胞浸潤，而侵襲性周緣中可見淋巴細胞浸潤C、D：免疫荒漠型,腫瘤中心與侵襲性周緣中均無淋巴細胞浸潤Fig.2 Representative images of tumor-infiltrating lymphocytes(TILs)in immune-limited and immune-cold patternA,B:immune-limited,no immune cell infiltration in the tumor center in different enlargement,and tumor-infiltrating lymphocytes can be seen in the invasive margin；C and D:Immune-cold,no tumor-infiltrating lymphocytes in tumor center and invasive margin

圖3 肝癌患者總體生存、無復發生存與免疫評分的Kaplan-Meier曲線A：免疫評分較高患者（I3～I4）生存期顯著高于免疫評分較低患者（I0～I2）B：免疫評分較高患者（I3～I4）無復發生存期顯著高于免疫評分較低患者（I0～I2）Fig.3 Kaplan-Meier curves comparing OS and PFS in patients with different immunoscore expressionA:overall survival rate of patients with HCC with a high or low immunoscore；B:progression-free survival of patients with HCC with a high or low immunoscore

研究發現腫瘤免疫細胞的浸潤可作為結直腸癌的預后標志物用于指導治療[3,12]。在分別評估不同腫瘤區域內（即腫瘤中心與侵襲性邊緣）免疫細胞浸潤的類型，定位和密度-稱為“免疫評分（immunoscore）”。免疫評分不僅可揭示腫瘤所在的免疫微環境，可以獨立預測患者的總生存與無復發生存，被認為是相對于標準TNM分期能夠更好地預測臨床結局[13,14]。免疫評分提出后有學者將其應用HCC的探索中[15]，然而結果尚未達成一致。

圖4 PD-L1胎盤組織陽性染色及癌旁組織陰性染色A、B：胎盤組織PD-L1陽性表達C、D：癌旁組織PD-L1陰性表達Fig.4 The positive expression of PD-L1 in human placenta tissue,and the negative expression in adjacent to cancer tissueA,B are the positive expression of PD-L1 in human placenta tissue,whereas C and D are the negative expression in adjacent to cancer tissue

表3 PD-L1在肝癌及癌旁組織中的表達率%Tab.3 Expression of PD-L1 in hepatocellular carcinoma and adjacent to cancer

由Sun等人[16]首次描述HCC患者腫瘤中心CD8+T細胞的預測值。其研究包括兩個獨立的患者群，隊列1包括從接受根治性切除90例患者的腫瘤樣品，隊列2包括從359名未經治療的HCC患者的腫瘤樣品，對不同區域的CD8+T和CD3+T細胞密度進行分析發現，腫瘤中心與侵襲性周緣處均為高細胞密度的患者與較長的PFS和OS顯著關聯。本實驗為小樣本的回顧性研究，亦發現對于復發性肝癌患者而言，免疫評分較高（I3～I4）患者的總生存期顯著高于免疫評分較低（I0～I2）的患者（χ2=11.39，P＜0.01）。免疫評分較高（I3～I4）患者的無復發生存期同樣顯著高于免疫評分較低（I0～I2）的患者（χ2=14.78，P＜0.01）。聯合分析顯示，患者CD3+T、CD8+T細胞在1～2個腫瘤區域（腫瘤中心或侵襲性邊緣）均為高密度可顯著降低肝癌的復發風險。

免疫評分與患者臨床特征進行統計學分析，免疫評分與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、脈管癌栓等臨床因素無相關性（P＞0.05），免疫評分與血清AFP增高（P＜0.05）及肝內復發（P＜0.05）具有相關性。AFP增高與腫瘤進展過程中產生大量內源性抗原，在一定程度內激發免疫反應，吸引淋巴細胞浸潤腫瘤內部與侵襲性邊緣。CD3+T、CD8+T淋巴細胞的分布模式分為3種：免疫炎型、免疫豁免型和免疫荒漠型。對于免疫炎型腫瘤，無論在TC與IM中均可見到大量淋巴細胞浸潤，可以在最大范圍限制腫瘤生長，發揮抗腫瘤免疫效應。而免疫豁免型可以看到大量淋巴細胞僅僅聚集于腫瘤周緣，很難進入腫瘤實質，免疫細胞呈現圍而不攻的狀態，提示腫瘤內部可能有大量免疫抑制因素的存在，通過對同一切片進行組化染色，發現PD-L1表達于腫瘤中心，提示腫瘤本身形成內源性抵抗微環境限制免疫細胞進入腫瘤實質，但是同樣發現并非所有免疫豁免型腫瘤可見到PD-L1陽性染色，提示可能還有其他免疫檢查點抑制通路在起作用，肝癌作為異質性極強的惡性腫瘤，本身就有獨特的免疫耐受微環境，腫瘤發展過程中涉及的免疫逃逸極為復雜，其與骨髓抑制細胞（MDSC）、腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）、癌癥相關成纖維細胞（CAFs）、調節性T細胞（Treg）等聚集有關[17]。而免疫荒漠型腫瘤在TC與IM中都難以見到效應T淋巴細胞，免疫效應細胞一片荒涼。免疫評分為I0的患者預后極差，極易出現早期復發與轉移，沒有免疫效應細胞及分子對其進行限制。針對免疫荒漠型腫瘤，僅僅通過解除免疫抑制的作用是遠遠不夠的，治療策略更應該傾向如何向腫瘤實質與間質中投入更多的士兵產生抗腫瘤免疫反應，可能通過介入治療的手段將更多具有殺傷活性的CAR-T細胞進行遞送，從而獲得更好的預后。

圖5 PD-L1在肝癌組織中不同陽性染色結果A、B、C：100×視野下肝癌組織分別呈弱陽性、陽性與強陽性表達D、E、F：200×視野下肝癌組織分別呈弱陽性、陽性與強陽性表達Fig.5 Expression of PD- L1 in hepatocellular carcinoma tissueA,B,C:100×view of HCC in the field of view is weak,positive and strong positive expression rate,respectively；D,E,F:200×view of HCC in the field of view is weak,positive and strong in positive expression rate,respectively

圖6 肝癌患者總體生存、無復發生存與PD-L1的Kaplan-Meier曲線A：PD-L1陽性患者總生存期低于PD-L1陰性患者B：PD-L1陽性患者無復發生存期顯著低于PD-L1陰性患者Fig.6 Kaplan-Meier curves comparing OS and PFS in patients with and without PD-L1 expressionA:overall survival rate of patients with HCC with a high or low expression of PD-L1；B:progression-free survival of patients with HCC with a high or low expression of PD-L1

表4 PD-L1的表達與免疫評分的相關性Tab.4 The relationship between the expression rate of PDL1 and immunoscore

免疫抑制分子PD-L1主要表達于腫瘤細胞和間質的淋巴細胞，PD-1表達在T細胞膜上的抑制性受體，與配體結合后通過進一步信號傳導使CD8+T細胞和CD4+T細胞失活，防止自身免疫性疾病的發生。腫瘤進展中，腫瘤細胞通過高表達PD-L1，大量傳遞抑制信號，減少CTL的增殖與聚集，并誘導細胞凋亡，產生免疫逃逸。本研究發現肝癌中PD-L1蛋白的陽性表達率為44.3%（27/61），其相應癌旁組織很少表達，兩者差異具有統計學意義（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存曲線分析表明，PD-L1蛋白陽性表達患者的總生存率顯著低于陰性表達的患者。相關性分析結果表明PD-L1表達與免疫評分具有負相關，提示在PD-L1高表達的患者中，應用免疫抑制劑可以提高局部免疫效應細胞及分子的浸潤，進而提高腫瘤的控制率。

對于多結節起源的原發性腫瘤，本實驗探索的結果是每一個結節即使分化程度相同，但是結節彼此之間的免疫細胞浸潤程度與PD-L1表達的量均各異。本組接下來的實驗將通過免疫組化或多色免疫熒光進行多中心起源性肝癌免疫微環境的表征探索。