幼期相對低劑量X線輻射對小鼠成年后學習記憶及海馬神經發生的影響

曾蕾，紀濤濤，周霖，柯祥杰，趙艷生，楊波,2，任伯緒，唐鋒儒

1.十堰市人民醫院（湖北醫藥學院附屬人民醫院）放射影像中心，湖北 十堰 442000；2.武漢大學中南醫院醫學影像科，武漢 430071；3.長江大學醫學院，湖北 荊州 434023；4.新加坡國立大學，新加坡核研究與安全倡議研究所，輻射生理實驗室，新加坡138062

相對高劑量電離輻射（＞10 Gy）如放療，尤其是針對腦或頭頸部腫瘤的放射治療會造成病人學習記憶障礙[1,2]。臨床研究表明，輻射所導致的學習記憶下降在腦腫瘤放療后長期幸存的患者中發生率高達50%[3]；動物研究也證實在高劑量的輻射暴露后，嚙齒類動物表現出學習記憶損害[4]。這些學習記憶損害表現多樣化，但是主要與海馬依賴性學習記憶下降有關，比如學習、記憶、注意力、執行力和空間處理能力的降低[5～7]。大量的臨床前期研究證明電離輻射所致的學習記憶損害與海馬齒狀回顆粒下層神經元再生能力下降密切相關[8]。電離輻射所致學習記憶改變與射線種類、劑量、劑量率、輻射方式（單次或分割）、生物體種類、品系、所處的發育階段、輻射后認知能力檢測時間點等因素皆相關[9～12]。當劑量相同時，年齡則是輻射所致神經行為學變化的重要易感因素，生長發育期的兒童會比成年人遭受更嚴重的學習記憶損害，其發生的機制可能也不完全相同[12～15]。然而目前研究大部分集中于成人、胚胎/胎兒受放療或高劑量輻射暴露后認知能力的改變[16,17]。對輻射所致學習記憶改變，大部分神經行為學檢測是輻射后短時期內測得，輻射所致長期學習記憶的改變仍需長時間的觀測和分析[18]。本研究在前期研究的基礎上[11,18,19]，進一步研究小鼠幼期接受相對低劑量的輻射（0.1～10 Gy）其成年后學習記憶及神經發生的改變，闡述相對低劑量電離輻射、學習記憶、神經發生之間的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級出生21 d昆明小鼠購自湖北省實驗動物研究中心（許可證號：SCXK(鄂)2018-0018），小鼠體重約（9.6±0.7）g。在室溫18～25℃、相對濕度50%～60%自然環境中用營養飼料分籠飼養，小鼠自由攝食及飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1 輻射損傷模型建立 小鼠隨機分為2組：正常對照組、5 Gy輻射組，每組10只。輻射組小鼠放入小動物輻射研究專用容器，射線源來自直線加速器（瑞典，Elekta），射線中心線高度和小鼠身體中心平齊，輻射組設置輻射劑量為5 Gy。

1.2.2 體重變化檢測 分別測量小鼠在2月齡、4月齡的體重，與21 d的體重作比較，比較輻射處理后至小鼠青春后期（21 d～2月齡）、至成年期（21 d～4月齡）的體重變化百分比。

1.2.3 曠場實驗 采用上海欣軟信息科技有限公司曠場實驗裝置、錄像及分析系統。操作者輕抓4月齡小鼠放在箱底中央，系統同步記錄小鼠5 min內自由探索的總路程[20]。

1.2.4 新物體識別實驗 采用上海欣軟信息科技有限公司新物體識別實驗裝置、錄像及分析系統，對4月齡小鼠行新物體識別實驗[21]。實驗分3個階段進行。適應期：第1～2 d，每天讓小鼠在實驗箱內自由活動30 min；熟悉期：第3 d，將O、F兩個相同物體分別放在實驗箱中，同步記錄15 min內小鼠對兩物體的探索情況，以小鼠鼻子或嘴巴接觸物體或距物體≤2 cm有效；測試期：第4 d，將物體O替換為物體N（N不同于O、F），記錄時間為5 min，其余步驟與熟悉期相同，每只小鼠在兩物體上的探索時間記為F、N。本實驗以辨別指數（identify index，DI）評價小鼠對新舊物體的識別記憶能力，計算公式為：DI=（N-F）/（N+F）。

1.2.5 條件性恐懼實驗 采用上海欣軟信息科技有限公司小鼠條件性恐懼實驗裝置、錄像及分析系統，對4月齡小鼠行條件性恐懼實驗[22]。實驗分為2個時期。訓練期：將小鼠放入斯金納箱中適應2 min后，給予20 s的聲刺激（80 dB，1000 Hz）和2 s的足部電刺激（0.85 mA），聲電刺激同步結束，間隔60 s后重復1次聲、電刺激。測試期：訓練結束后分別于24 h和（24+1）h行環境關聯性和線索關聯性恐懼測試，環境關聯恐懼測試中不給予聲電刺激，記錄小鼠280 s內小鼠僵直時間。線索關聯性恐懼測試中給予聲刺激但不給予電刺激，記錄280s內小鼠僵直時間。本實驗以測試期小鼠分別在環境關聯性和線索關聯性恐懼測試中280 s內僵直時間（s）作為恐懼學習記憶的指標。

1.2.6 Morris水迷宮實驗 采用上海欣軟信息科技有限公司水迷宮實驗裝置、錄像及分析系統，對4月齡小鼠行Morris水迷宮實驗[23]。實驗分為兩個階段。（1）定位航行實驗：歷時5 d。第1 d，從池壁4個象限中第1象限的中點將小鼠放入水中，記錄小鼠找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期（s）。若小鼠60 s內找到水下平臺則逃避潛伏期記為X s，并在平臺上休息15 s；若60 s內未找到平臺則逃避潛伏期記為60 s，則將小鼠引導上平臺，同樣在平臺上休息15 s。每個象限實驗結束后小鼠休息60 s再進行下一象限實驗，直至4個象限實驗完成。后4 d重復操作同第1 d。（2）空間探查試驗：第6 d撤去平臺，將小鼠從原平臺所在象限的對側象限入水，記錄小鼠在60 s內穿越原平臺的次數。本實驗以小鼠在定位航行實驗中逃避潛伏期t（s）和空間探查實驗中穿越原平臺的次數n（次）作為小鼠空間學習記憶的指標。

1.2.7 取材及冰凍切片制作 將6月齡小鼠用1%戊巴比妥鈉（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉后剪開胸腹腔，暴露肝及心，取灌注針自心尖向右上45°進針至主動脈起始端，用止血鉗固定針頭，剪破右心耳，快速灌注生理鹽水約30 ml至肝變白，換4%多聚甲醛200 ml灌注。最后剪開顱骨，斷頭剝離腦組織并放入4%多聚甲醛后固定24 h后轉入30%蔗糖溶液中4℃保存直至組織沉入瓶底。將小鼠腦組織從30%蔗糖溶液中取出，沿正中矢狀位剖開。取其中一半腦組織用OCT包埋后行液氮冷凍，恒溫冰凍切片機（德國，Leica）連續切片，片厚約40μm，將含海馬組織的切片依次放入裝有0.1 M PB溶液的24孔板的其中4孔內，最終每孔內含約6～8片含海馬組織的腦片。

1.2.8 免疫組化染色 采用SABC法進行免疫組化染色。腦片用0.1 mol/L PBS洗滌3次，經3%H2O210 min、山羊血清2孔（1：50，Vector公司，瑞士）和驢血清1孔（1：50，Santa Cruz公司，美國）室溫封閉2 h，吸棄封閉液后一孔山羊血清中加入一抗Ki67（1：200，GeneTex公司，美國），和另一份山羊血清中加入一抗PV（1：4000，Swant公司，美國），驢血清中加入一抗DCX（1：200，Santa Cruz公司，美國）4℃過夜孵育，PBST（PBS中加入0.1%Triton-X100，pH 7.6）洗滌3次，加入生物素標記的山羊抗兔IgG（1：100，Vector公司，瑞士）和驢抗山羊IgG（1：100，Santa Cruz公司，美國）室溫孵育1 h；PBST洗滌后AB液（1：50，Vector公司，瑞士）孵育0.5 h，最后DAB（Vector公司，瑞士）顯色，裱片后顯微鏡觀察結果并照相。

1.2.9 細胞計數 各組取自每只小鼠一半腦組織含海馬結構的片子（8～10片）納入觀察。每一張切片在10×10倍鏡下采用Immage-pro plus軟件（IPP，6.0）計數海DG區各指標單位面積陽性細胞數。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 體重增加量檢測結果

5 Gy輻射組小鼠在輻射期（21 d）至青春后期（2月齡）期間體重增加百分比（150.34±23.46）%低于對照組（191.44±15.11）%，t=3.02，*P＜0.05；在輻射期至成年期（4月齡）輻射組小鼠體重增加百分比（199.01±21.93）%顯著低于對照組（260.31±21.27）%，t=4.22，**P＜0.01，見圖1。

圖1 兩組小鼠2月齡（*P＜0.05，n=10）和4月齡體重增加百分比的比較（**P＜0.01，n=10）Fig.1 Comparison of body weight gain percentage at 2 months(*P＜0.05,n=10)and 4 months(**P＜0.05,n=10)of agebetween thetwo groups

2.2 行為學測試結果

2.2.1 曠場實驗測試結果 對照組、5 Gy輻射組小鼠4月齡在曠場實驗中5 min內自由探索總路程分別為（33055.92±2601.40）mm、（37773.01±5086.99）mm，無統計學差異（t=-1.672，P＞0.05），見圖2。

2.2.2 新物體識別實驗測試結果 對照組、5 Gy輻射組小鼠4月齡在新物體識別實驗中對新舊物體的識別能力（DI）分別為（0.70±0.15）、（0.61±0.21），無統計學差異（t=0.753，P＞0.05），見圖3。

2.2.3 條件性恐懼實驗測試結果 對照組、5 Gy輻射組小鼠4月齡在條件性恐懼實驗中環境關聯性恐懼的僵直時間分別為（12.31±4.43）s、（19.59±6.39）s，無統計學差異（t=-0.885，P＞0.05）；線索關聯性恐懼的僵直反應時間分別為（42.70±21.78）s、（39.08±12.88）s，亦無統計學差異（t=0.15，P＞0.05），見圖4。

2.2.4 Morris水迷宮實驗測試結果 經Morris水迷宮實驗測試，對照組、5 Gy輻射組小鼠在定位航行中第1～5 d內每天逃避潛伏期無統計學差異（F=2.30，P＞0.05）；在空間探查實驗中兩組小鼠60 s內穿越平臺的次數無統計學差異（t=-1.07，P＞0.05）,具體見表1，圖5。

圖2 曠場實驗測試，兩組小鼠5 min內自由探索度無統計學差異（P＞0.05，n=10）Fig.2 Comparison of distance traveled within 5 min in the open field test between the two groups(P＞0.05,n=10)

圖3 新物體識別實驗測試，兩組小鼠對新舊物體辨別能力無統計學差異（P＞0.05，n=10）Fig.3 Comparison of recognition memory between the two groups of mice in the new object recognition experiment(P＞0.05,n=10)

2.3 免疫組化檢測結果

2.3.1 Ki67標記的陽性細胞表達結果 兩組小鼠海馬SGZ區均可見棕黃色ki67核蛋白表達；5 Gy輻射組海馬SGZ區Ki67陽性細胞數為（40.00±19.06）/mm2，低于對照組（66.10±22.47）/mm2，t=2.80，*P＜0.05，見圖6。

2.3.2 DCX標記的陽性細胞表達結果 兩組小鼠海馬DG區均可見棕黃色DCX蛋白表達，主要定位于神經元胞漿、樹突和軸突，其突起穿過顆粒細胞層到達分子層；5 Gy輻射組海馬DG區DCX陽性神經元為（66.90±46.05）/mm2，顯著低于對照組（315.20±109.20）/mm2，t=6.63，***P＜0.001，見圖7。

2.3.3 CB標記的陽性細胞表達結果 兩組小鼠海馬DG區均可見棕黃色CB蛋白表達，主要定位于DG區顆粒細胞層神經元胞體的胞漿；5 Gy輻射組小鼠海馬DG區CB陽性神經元為（1000±353）/mm2，顯著低于對照組（2061±822）/mm2，t=3.75，**P＜0.01，見圖8。

2.3.4 PV標記的陽性細胞表達結果 兩組小鼠海馬DG區均可見棕黃色PV蛋白表達，主要定位于DG區神經元胞體的胞漿、樹突。5 Gy輻射組小鼠海馬DG區PV陽性神經元為（18.70±10.59）/mm2，顯著低于對照組（66.60±26.03）/mm2，t=5.39，***P＜0.001，見圖9。

3 討論

圖4 條件性恐懼實驗測試，兩組小鼠環境關聯性僵直時間（A）與線索關聯性僵直時間（B）均無統計學差異，P＞0.05，n=10Fig.4 Comparison of contextual memory related freezing time(figure A,P＞0.05,n=10))and clued memory related freezing time(figure B,P＞0.05,n=10))in conditioned fear experiment between the two groupsof mice

高劑量的電離輻射會擾亂生長發育、造成內分泌紊亂及學習記憶下降[1,2]。臨床研究表明電離輻射所致的海馬損傷在接受全腦或局部輻射后的病人的神經認知下降中扮演著重要角色，尤其會引起與學習、記憶和空間信息處理能力相關的學習記憶損害[5～7]。動物研究表明電離輻射后海馬依賴性學習記憶的下降主要歸因于神經發生能力的減弱[8]。

表1 小鼠Morris水迷宮實驗結果（±s,n=10）Tab.1 Comparison of escaping latency in the spatial reference memory task and the platform crossing times in the probe test in Morris water maze between the two groups of mice（Mean±SD,n=10）

表1 小鼠Morris水迷宮實驗結果（±s,n=10）Tab.1 Comparison of escaping latency in the spatial reference memory task and the platform crossing times in the probe test in Morris water maze between the two groups of mice（Mean±SD,n=10）

注：與對照組相比，P＞0.05Compared with control group,P＞0.05

圖5 Morris水迷宮實驗，兩組小鼠逃避潛伏期（A）與穿越平臺次數（B）均無統計學差異，P＞0.05，n=10Fig.5 Comparison of escaping latency in the spatial reference memory task(figure A,P＞0.05,n=10),and the platform crossing times in the probe test in Morris water maze between the two groups of mice(figure B,P＞0.05,n=10)

圖6 免疫組化檢測小鼠海馬SGZ區的Ki67陽性細胞表達結果A：對照組腦片鏡下觀B：5 Gy輻射組腦片鏡下觀C：統計圖箭頭所指為Ki67陽性細胞*P＜0.05,n=10Fig.6 The Ki67 immunopositive cells in the SGZ of hippocampusA:Brain immunohistochemical image of the control group mice B:Brain immunohistochemical image of the 5 Gy irradiation group mice C:Statistical diagram of thetwo groupsThe Ki67 positive cells was indicated by the arrows,*P＜0.05,n=10

圖7 小鼠海馬DG區DCX陽性神經元表達檢測結果（×20）A：對照組腦片鏡下觀B：5 Gy輻射組腦片鏡下觀C：統計圖箭頭所指為DCX陽性神經元***P＜0.001 n=10Fig.7 The DCX immunopositive neurons in the DG of hippocampus(×20)A:Brain immunohistochemical image of the control group mice B:Brain immunohistochemical image of the 5 Gy irradiation group mice C:Statistical diagram of thetwo groupsThe DCX positiveneurons was indicated by the arrows,***P＜0.001,n=10

圖8 小鼠海馬DG區CB陽性神經元表達檢測A：對照組腦片鏡下觀B：5 Gy輻射組腦片鏡下觀C：統計圖 箭頭所指為CB陽性神經元***P＜0.01 n=10Fig.8 The CB immunopositive interneurons in the DG of hippocampusA:Brain immunohistochemical image of the control group mice B:Brain immunohistochemical image of the 5 Gy irradiation group mice C:Statistical diagram of the two groups The CB positive interneurons was indicated by the arrows,***P＜0.01,n=10

輻射劑量是衡量能否產生認知缺陷的一個關鍵因素。多個團隊研究證實輻射所導致條件性恐懼記憶、空間記憶的下降呈劑量依賴性[24]。Ji等[25]觀察到1次30 Gy（而不是10 Gy）的輻射劑量會造成大鼠學習記憶損害，此外，輻射持續抑制BDNF基因的轉錄與海馬齒狀回神經發生的長期損害有關。有學者[1]發現1次10 Gy的輻射劑量會造成小鼠海馬依賴性空間學習記憶能力的下降，但是海馬大體結構并沒有明顯變化。Rola等[26]報道了在輻射劑量降至5 Gy時，對出生21 d的小鼠進行1次輻射，3個月后觀察到海馬區神經發生能力及海馬依賴性記憶功能的下降。本團隊前期的研究表明，5 Gy的輻射劑量會造成小鼠在條件恐懼實驗中環境關聯性恐懼學習記憶及新物體識別實驗中辨別記憶能力的下降，同時觀察到海馬齒狀回神經發生能力的下降[11]。本實驗中相同劑量的輻射（5 Gy）并未造成成年后小鼠自由活動能力、物體識別記憶、環境相關性及線索相關性恐懼記憶、空間信息處理能力的改變，可能與輻射所用的射線種類、能量高低、劑量率、小鼠品系、行為學測試時間點等其他一系列復雜因素有關。本實驗中所用的X射線的輻射損傷作用比γ射線要弱；昆明小鼠可能比相同周齡的BALB/c小鼠更抗輻射；輻射后檢測期的延長可能導致學習記憶損害程度的減弱或者部分恢復。神經發生能力降低與前期研究結果一致，表明5 Gy的輻射劑量足以造成海馬神經發生能力的損害。

輻射產生時生物所處的發育階段是影響輻射后認知效果的另一重要因素[27]。研究表明，年長的動物在輻射后并未表現出持續性的未成熟神經元和成熟神經元的缺失，但是表現出顯著的炎癥反應，這與年幼動物在輻射損傷后主要表現出神經發生的減弱不同，而輻射后年幼和年長動物表現出的學習記憶損害卻有很多相同之處[28]。本實驗年幼動物輻射后神經發生和成熟神經元的減弱一直持續至成年期，與輻射損傷神經發生過程中神經干細胞的增殖、分裂、分化、遷移、成熟一系列進程受損密切相關。

輻射所致的神經發生和學習記憶的損害在短期效應和長期效應的檢測中也是多變和復雜的[29,30]。比如在認知層面，Zhou等[30]發現年幼的大鼠接受1次20 Gy或40 Gy的輻射，4周后均表現出學習記憶損害，8周后測試只有接受40 Gy輻射的大鼠表現出認知損害，12個月后兩組大鼠已檢測不到認知損害。在神經發生層面，Silasi等[31]實驗中小鼠接受1次0.5 Gy的X線輻射2 h后未檢測到神經發生下降，但是12 h后卻檢測到凋亡細胞明顯增加、神經發生明顯下降。進一步研究發現，2周后神經發生可以恢復到正常水平[32]。本實驗中小鼠出生21 d時接受5 Gy劑量的X線輻射，4個月后檢測到海馬DG區神經再生的損害，說明幼期5 Gy劑量的輻射可造成小鼠神經再生減弱長久持續存在且不能逆轉到正常水平；但是，學習記憶未檢測到損害，可能表明當神經元數量降低到一定程度時才會引起學習記憶缺陷，或是大腦通過增強其它執行相同功能的神經元的作用對抗損害的神經功能，或是小鼠在生長發育過程中大腦通過修復作用修復了部分缺失的神經元的功能，亦或是大腦通過其他神經元或腦區/核團的代償/替代作用彌補了缺失的認知功能。

神經發生包括神經干細胞的增殖、分裂、分化、遷移、成熟等一系列連續進程，各階段表達不同的神經元標記物。Ki67僅在周期性分裂的細胞核中表達，其表達隨細胞周期進展而增加，在G0期和G1早期不表達，G1中期到后期開始出現，S期的后半程增加明顯，G2、M期到達高峰[33]。Ki67在海馬齒狀回SGZ區的陽性表達即為SGZ區神經發生中處于增殖期的神經元。本實驗中兩組小鼠SGZ區Ki67陽性細胞數的顯著差異說明了21 d時5 Gy的X線輻射劑量對小鼠神經發生過程中神經元的分裂增殖具有損害作用，已直接或間接導致了海馬SGZ區分裂增殖的神經元的減少。雙皮質素（doublecortin，DCX）主要表達于遷移中的神經元胞體和前導突起上以及分化中的神經元軸突，故常用來鑒定未成熟神經元[34]。本實驗中兩組小鼠DG區DCX陽性細胞數的顯著差異說明了21 d時5 Gy的輻射劑量對小鼠神經發生過程中神經元的遷移分化具有抑制作用，已直接或間接引起了海馬DG區處于遷移、分化中的未成熟神經元的減少。鈣結合蛋白（calcium-binding proteins，CBP）：Calbindin（CB），Calretinin（CR）和Parvalbumin（PV）表達于成熟的中間神經元，代表著海馬GABA能中間神經元的3個群體，具有各自的分布和功能特點[35]。本實驗兩組小鼠CB、PV陽性細胞數的顯著差異說明了21 d時5 Gy的X線輻射劑量對小鼠神經發生或成熟神經元具有損傷作用，已直接或間接導致了海馬DG區成熟、中間神經元的減少。

電離輻射所致的學習記憶損害取決于一系列因素，這些因素間相互或共同協作，由此導致復雜多變的學習記憶缺陷，其機制更是撲朔迷離、爭議不斷。神經發生減弱是學習記憶下降的一個重要機制。研究輻射所致的認知功能的損害及其機制需要綜合考慮各種因素更加詳盡細致深入地分析，進而為輻射防護提供參考，為研究開發抗輻射藥物、修復輻射所致認知及神經損傷的藥物提供理論依據和技術支撐。