我國部分地區(qū)乳房炎奶樣中大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

于 雷，鄒本革，韓榮偉,石潤佳，張文青，解書斌，于忠娜*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽 265200；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109)

乳房炎是危害全世界奶牛的主要疾病之一。乳房炎不僅會對奶牛的健康造成極大的危害，也是養(yǎng)殖場經(jīng)濟損失的主要來源。此外，乳制品中細(xì)菌及毒素的脫落也使得乳腺炎具有嚴(yán)重的人畜共患病風(fēng)險[1]。引起牛乳房炎感染的病原體可分為傳染性和環(huán)境性病原體[2]。其中，大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的主要環(huán)境性病原體之一[3]，也是引起毒性和致命性乳腺炎的最常見原因[4]。研究表明，大腸桿菌乳腺炎的嚴(yán)重性主要受患病奶牛的健康狀況、泌乳階段、胎次和遺傳背景等影響[5]。由大腸桿菌引起的乳腺炎往往是急性發(fā)作，即使患病奶牛的臨床癥狀和病菌消失，腺體在長時間內(nèi)仍會受到影響，在此期間，乳品成分也會持續(xù)受到影響，從而對乳制品生產(chǎn)造成經(jīng)濟影響[6]。研究顯示，奶牛乳房炎是牛場抗菌藥物使用的主要原因[7]。但大部分養(yǎng)殖戶對奶牛乳房炎病情和抗菌藥物的用量不能很好掌握，奶牛場中未經(jīng)控制的使用抗菌藥物會增加細(xì)菌的耐藥性，從而導(dǎo)致治療的失敗。吳利軍等[8]的研究發(fā)現(xiàn)湖北一牛場奶牛乳房炎乳樣大腸桿菌對林可霉素、青霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明存在耐藥性；尤從彪等[9]的研究發(fā)現(xiàn)甘肅省武威市涼州區(qū)乳房炎奶樣中大腸埃希氏菌對氨芐西林、鏈霉素、四環(huán)素等的耐藥性較強, 對慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素敏感；廖智慧等[10]的研究發(fā)現(xiàn)河北衡水地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌對頭孢克肟、恩諾沙星、丁胺卡那、強力霉素4種藥物敏感, 對磺胺異噁唑、鏈霉素、阿莫西林耐藥率在80%～100%之間。可見，不同地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌分離株對常用抗菌藥物的抗藥性明顯不同。因此，定期對主要病原菌進行相應(yīng)藥物的敏感性試驗，針對不同地區(qū)不同農(nóng)場選擇性地使用藥物，可以有效提高藥物的治療效果，從而減少牛乳中抗菌藥物的殘留。鑒于此，本試驗無菌采集2019年7～8月份陜西、山東、新疆、北京、上海、黑龍江等六個省、市、自治區(qū)患有乳房炎的158例奶牛的奶樣，對其進行大腸桿菌的分離鑒定和藥敏性試驗，從而指導(dǎo)牛場合理使用抗菌藥物，提高治療效果和畜產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶樣來源 陜西、上海、山東、新疆、北京、黑龍江等六個省、市、自治區(qū)的患有乳房炎的奶牛的奶樣，共計158份。

1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，Mueller-Hintonq瓊脂(MHA)，伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)，大腸桿菌生化鑒定管(DCSN)，Kovacs氏靛基質(zhì)，甲基紅指示劑，V-P試劑，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；抗生素試紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 單人雙面垂直凈化工作臺，SW-CJ-1F，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，LS-30，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱，SPX型，寧波東南儀器有限公司；旋渦混合器，QL-866，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 奶樣來源 對患乳房炎的奶牛乳房，按常規(guī)方法消毒后收集奶樣。去掉乳房出奶的前三把，無菌條件下采集15 mL，貼好標(biāo)簽，4 ℃保存，24 h內(nèi)檢測[11]。

1.2.2 大腸桿菌的分離純化 參照文獻[12]的方法進行。在超凈工作臺上將采集的158例奶樣，取2 mL于20 mL TSB培養(yǎng)基，充分混勻后37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，待用。用無菌接種環(huán)蘸取增菌液，在EMB培養(yǎng)基中四區(qū)劃線后37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。之后挑出在EMB培養(yǎng)基中呈現(xiàn)紫黑色或者純紫色，并且對光觀察有金屬光澤的菌落，無菌挑入準(zhǔn)備好的TSB肉湯中，放入37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h備用。

1.2.3 乳房炎奶樣大腸桿菌的鑒定 無菌挑取上述菌落分別接種于蛋白胨水(色氨酸肉湯)，MR-VP(2支)和西蒙氏檸檬酸鹽生化反應(yīng)管。結(jié)果參照GB/T4789.38-2012 標(biāo)準(zhǔn)判定，生化鑒定結(jié)果比照表見表1。

表1 生化鑒定結(jié)果比照表

1.2.4 藥敏試驗 大腸桿菌的藥敏試驗采用紙片擴散法檢測常用六類19種抗菌藥物的耐藥率，具體步驟參照文獻[12]。用移液槍移取1.6 mL大腸桿菌菌種于20 mL無菌水的試管中，用無菌面蘸取無菌水中菌液，均勻的涂抹在MHA培養(yǎng)基上，再用鑷子夾取藥敏片呈三角狀均勻的放置在MHA培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基上放4個藥敏片。將放好藥敏片的培養(yǎng)基做好標(biāo)記，然后在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，測量藥敏片周圍透明光環(huán)的直徑并進行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌鑒定結(jié)果 經(jīng)分離純化，從158例奶樣中鑒定出疑似大腸桿菌57例，經(jīng)生化鑒定確認(rèn)大腸桿菌株38例，檢出率為24.1%，具體結(jié)果見表2。

表2 大腸桿菌鑒定結(jié)果表

2.2 藥敏試驗

2.2.1 大腸桿菌分離菌株藥敏試驗 38株大腸桿菌分離株對19種藥物的藥敏試驗見表3。同一株大腸桿菌在不同的藥物作用下所表現(xiàn)的耐藥性差異很大，從0到73.7%，其中磺胺異噁唑耐藥率最高，為73.7%。大腸桿菌分離株對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、鏈霉素藥物的敏感率達(dá)到100%。

表3 大腸桿菌分離株藥敏試驗結(jié)果

2.2.2 單菌株多重耐藥性分析 對38株大腸桿菌的單株耐藥性分析見圖1。試驗結(jié)果表明，大腸桿菌分離菌株最多耐13種藥物，最少耐4種藥物。其中12株耐5種藥物、10株耐6種藥物，這些菌株均對磺胺異噁唑、頭孢噻吩兩種藥物具有耐藥性；7株耐7種藥物，這些菌株均對頭孢噻肟、氨芐西林、頭孢噻吩和磺胺異噁唑四種藥物具有耐藥性。

圖1 大腸桿菌分離株多重耐藥情況

2.3 不同地區(qū)大腸桿菌分離株藥敏試驗結(jié)果 對上海、山東、北京、新疆、黑龍江五地患病奶牛奶樣中大腸桿菌分離株藥敏試驗結(jié)果見表4。從表4可見，不同地區(qū)分離的大腸桿菌對同一種抗菌藥物耐藥性差異很大，頭孢哌酮在上海地區(qū)耐藥率為100%，在山東地區(qū)耐藥率為75%，而在北京地區(qū)的敏感率為100%；頭孢西丁和慶大霉素在上海地區(qū)耐藥率為100%，而在其他四個地區(qū)的敏感率均為100%。

表4 不同地區(qū)大腸桿菌分離株藥敏試驗結(jié)果(%)

2.4 不同地區(qū)大腸桿菌分離株對六類抗生素耐藥情況 上海、山東、北京、新疆、黑龍江五地患病奶牛奶樣中大腸桿菌分離株對六類抗生素耐藥情況見表5。從表5可見，上海和山東地區(qū)對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況很嚴(yán)重，耐藥率高達(dá)75%以上；黑龍江和新疆地區(qū)對此類藥物的耐藥率分別為44.4%和4.0%。對于喹諾酮類藥物，只有黑龍江地區(qū)對此類藥物出現(xiàn)耐藥，耐藥率為1.9%，其他地區(qū)都為0。山東和黑龍江地區(qū)對四環(huán)素類藥物耐藥率分別為12.5%和2.8%，其他地區(qū)耐藥率均為0。黑龍江地區(qū)對于磺胺類藥物耐藥率為52.5%，上海和新疆地區(qū)對磺胺類藥物的耐藥效果相同，均為50%，北京地區(qū)耐藥率為33.3%。氨基糖苷類藥物在上海和黑龍江耐藥率分別為20.0%和1.1%，其他地區(qū)均為0。氯霉素類藥物在上海和山東的耐藥率為66.7%和50%，其他三省的耐藥率均為0。

表5 不同地區(qū)大腸桿菌分離株對六類抗生素耐藥情況(%)

3 討 論

目前，國內(nèi)外對乳房炎治療的藥物以抗菌藥物為主，再加上很多農(nóng)場對抗生素不科學(xué)的使用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷增多[13]，大腸桿菌的耐藥性也越來越強。本試驗對38株臨床分離的奶牛乳房炎大腸桿菌進行了藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株對19種抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度耐藥性，不同地區(qū)分離的大腸桿菌對同一種抗菌藥物敏感性差異很大。其中上海和山東地區(qū)對β-內(nèi)酰胺類藥物和氯霉素類藥物的耐藥情況比較嚴(yán)重，耐藥率高達(dá)50%以上，因此，上海和山東地區(qū)在治療患乳房炎奶牛應(yīng)盡量避免使用β-內(nèi)酰胺類藥物和氯霉素類藥物。黑龍江、上海和新疆地區(qū)對磺胺類藥物的耐藥效果均超過50%，因此，這些地區(qū)在治療患乳房炎奶牛時不建議使用磺胺類藥物，若需要使用此類藥物，必須注意藥物的使用劑量和要求，防止耐藥率的進一步提高。本研究發(fā)現(xiàn)各地區(qū)大腸桿菌分離株對喹諾酮類藥物、四環(huán)素類藥物和氨基糖苷類藥物耐藥率極低，因此，在治療奶牛大腸桿菌源乳房炎時可搭配此類藥物提高療效。大腸桿菌分離菌株最多耐13種藥物，最少耐4種藥物，菌株數(shù)最多的是耐5種藥物。這種多重耐藥性的出現(xiàn)可能跟不科學(xué)使用抗菌藥物有關(guān)。石潤佳等[11]的研究發(fā)現(xiàn)華北地區(qū)乳房炎奶樣中大腸桿菌分離株對至少 4 種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，最多耐藥19種，耐藥5種的菌株較多(58.82%)。

據(jù)研究報道，許多編碼抗菌藥物耐藥性的基因位于細(xì)菌質(zhì)粒上，而細(xì)菌耐藥性可以通過質(zhì)粒水平傳播到另一株細(xì)菌，使得有些耐藥菌株有可能在動物和人體內(nèi)相互傳播，引起危險的人類疾病，對人體的健康安全產(chǎn)生極大的影響，因此，也可以通過研究細(xì)菌基因內(nèi)所攜帶的耐藥基因來分析細(xì)菌的耐藥性，具體可通過脈沖場凝膠電泳(PFGE)、PCR、MLST等方法來實現(xiàn)[14]。

畜牧養(yǎng)殖過程中頻繁使用抗菌藥物會造成耐藥性增強、環(huán)境污染以及畜產(chǎn)品中的藥物殘留，最終也會對人類的健康產(chǎn)生極大的危害[15-17]。中草藥因其無抗藥性、無污染、無殘留等優(yōu)點，可成為抗菌藥物的理想替代品，在奶牛乳房炎的防治中具有廣闊的發(fā)展前景，應(yīng)成為未來研究的重點。開發(fā)中草藥防治奶牛乳房炎，減少耐藥性、藥物殘留等一系列問題對實現(xiàn)綠色健康養(yǎng)殖及達(dá)到國家“十二五”規(guī)劃對乳品行業(yè)的要求也具有重要意義[18]。