HPLC法同時(shí)測定采后蓮霧果實(shí)7 種有機(jī)酸的含量

段云飛，吳光斌,*，葉 洪，陳昭華，張 珅，陳發(fā)河

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361000；2.寧德海關(guān)技術(shù)中心，福建 寧德 352100）

蓮霧（Syzygium samarangenese[Blume] Merrill &L.M.Perry）又名洋蒲桃、爪哇蒲桃、水蒲桃、甜霧等，為桃金娘科（Myartecae）蒲桃屬水果[1]，原產(chǎn)于馬來西亞、印度尼西亞和印度等國家，17世紀(jì)中國臺(tái)灣最早引種[2]，是著名的熱帶亞熱帶水果。蓮霧果實(shí)色澤艷麗，果形獨(dú)特，清甜多汁，有特殊水果香味。蓮霧果實(shí)中含有豐富的花青素、酚酸、有機(jī)酸和VC等多種有效成分[3-4]，有調(diào)節(jié)血脂、消炎、調(diào)節(jié)血糖、改善血液循環(huán)、減肥、清涼解渴等功效，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5-8]。

有機(jī)酸作為果實(shí)風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)的重要構(gòu)成因素，影響水果的口感、色澤及生物穩(wěn)定性，同時(shí)還是果品成熟度、耐藏性以及加工性的重要依據(jù)。有機(jī)酸是蓮霧果實(shí)中的主要風(fēng)味物質(zhì)，其含量與蓮霧的風(fēng)味及品質(zhì)密切相關(guān)，所以對(duì)蓮霧中有機(jī)酸含量的檢測具有重要意義[9]。有機(jī)酸含量的檢測方法較多，主要有酶法[10-12]、氣相色譜法[13-15]、毛細(xì)管電泳法[16-17]、離子色譜法[18-19]等。酶法每次只能測定一種有機(jī)酸；氣相色譜法需要對(duì)不易揮發(fā)的有機(jī)酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，過程較繁瑣；毛細(xì)管電泳法分離度較高，但穩(wěn)定性較差，準(zhǔn)確度不高，精密度不好。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法是當(dāng)前普遍采用的分析有機(jī)酸的方法[20-23]，該方法具有分離效率高、準(zhǔn)確度高和精密度好等優(yōu)點(diǎn)，因此被越來越多的利用于快速檢測領(lǐng)域。

本研究表明，采后蓮霧果實(shí)絮狀綿軟和品質(zhì)劣變進(jìn)程與呼吸和能量代謝密切相關(guān)[24-25]，分析有機(jī)酸的變化是研究呼吸和能量代謝途徑變化的重要手段。目前，關(guān)于蓮霧果實(shí)中多種有機(jī)酸的HPLC法定量分析鮮見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用HPLC法對(duì)采后蓮霧果實(shí)中有機(jī)酸的含量同時(shí)進(jìn)行測定，并建立相應(yīng)的測定方法，以期為采后貯藏過程中蓮霧果實(shí)的品質(zhì)變化和生理代謝提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以當(dāng)日抵達(dá)福建廈門中國臺(tái)灣水果集散中心的‘蜜風(fēng)鈴’蓮霧（Syzygium samarangenese[Blume] Merrill &L.M.Perry）為材料。選擇形狀大小、成熟度基本一致、沒有病蟲害且無機(jī)械損傷的蓮霧，于溫度為（4f 0.5）℃、相對(duì)濕度為（85f 2）%的條件下貯藏。

丙酮酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 美國Sigma公司；磷酸二氫鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀（配有1314紫外檢測器） 安捷倫科技有限公司；高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；RIOS 8超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；AW 220托盤電子分析天平 日本島津公司；PE 20 K型pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；KQ數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲波儀器有限公司；LHS智能恒溫恒濕箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ULT1386超低溫冰箱（-80 ℃）美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Atlanis T3色譜柱（4.6 mmh 250 mm，5 μm），流動(dòng)相為pH 2.2的0.02 mol/L NaH2PO4緩沖溶液（A）-甲醇溶液（B），梯度洗脫：0～8 min，100%～75% A、0%～15% B；8～17 min，75%～70% A、15%～30% B；17～26 min，70%～100% A、30%～0% B；柱溫25 ℃，流速0.5 mL/min，檢測波長213 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 溶液的配制

緩沖溶液：配制0.02 mol/L的NaH2PO4溶液，用H3PO4調(diào)節(jié)pH 2.2作為流動(dòng)相，超聲后用0.45 μm的水相濾膜過濾。

單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取適量丙酮酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品分別置于50 mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖溶液溶解稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為0.750、3.000、0.010、0.050、0.300、1.500、0.096 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量的各單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至2、5、10、50、150、300 倍，得到梯度混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.3 樣品溶液的提取

參照郭根和等[26]的方法，稱取蓮霧果肉15 g，用研缽研成勻漿，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加入適量的流動(dòng)相溶液，于75 ℃水浴加熱浸提45 min，冷卻至室溫后定容。旋渦振蕩2 min，超聲提取30 min后過濾。取一定量的濾液，以4 000 r/min離心30 min，分離沉淀蛋白質(zhì)、果膠等干擾物質(zhì)，取上清液用0.45 μm孔徑的濾膜過濾，濾液即為樣液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，Adobe Photoshop軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理。測定數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

分別對(duì)7 種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明7 種有機(jī)酸在213 nm附近均有較大吸收，故選擇213 nm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 流動(dòng)相梯度的選擇

首先采用等度洗脫的方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)成分很難與干擾峰有效分離，出峰時(shí)間太晚且拖尾嚴(yán)重。而采用1.3.1節(jié)梯度洗脫的方式，則有較大改善，丙酮酸、蘋果酸、乙酸和檸檬酸等峰能與干擾峰有效分離，峰形較好。在上述優(yōu)化條件下，7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品及蓮霧樣品的液相色譜圖如圖1所示，其相鄰峰的峰形最佳，分離度較好，可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）及蓮霧樣品（B）的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of seven organic acids in mixed standard solution (A) and those in wax apple sample (B)

2.3 流動(dòng)相及其濃度的選擇

有機(jī)酸在水相中大部分以離子態(tài)存在，而離子在反相色譜柱上幾乎無保留，故采用抑制電離的方法，使其變?yōu)榉肿討B(tài)酸在柱子上保留而得到分離。NaH2PO4緩沖溶液作為一種弱酸電離抑制劑在紫外區(qū)幾乎無吸收，因此，用其作為測定有機(jī)酸的流動(dòng)相，有利于有機(jī)酸的分離而不影響檢測。

分別考察0.01、0.02、0.05 mol/L的NaH2PO4溶液對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明：當(dāng)流動(dòng)相濃度為0.01 mol/L時(shí)，丙酮酸和蘋果酸、乙酸和檸檬酸分離度均小于1.5，不能很好地分離；當(dāng)流動(dòng)相濃度大于0.02 mol/L時(shí)，丙酮酸和蘋果酸、乙酸和檸檬酸分離效果有較大改善，分離度大于1.5；0.05 mol/L的磷酸鹽溶液對(duì)分離效果影響不大，并且較高濃度的鹽溶液會(huì)對(duì)泵和柱子的壽命產(chǎn)生影響。綜合考慮，選擇0.02 mol/L的NaH2PO4溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 流動(dòng)相pH值的選擇

有機(jī)酸為弱酸，極性較大，流動(dòng)相中水的比例很高，常發(fā)生酸電離。為了使有機(jī)酸盡可能以分子形式存在，一般使用酸性流動(dòng)相抑制有機(jī)酸的解離，可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值以達(dá)到抑制解離的作用。當(dāng)pH值從2.2增加到2.4時(shí)，各有機(jī)酸的保留時(shí)間逐漸縮短；pH 2.4時(shí)，乙酸和檸檬酸重疊且有明顯的前沿峰；pH 2.3時(shí)，乙酸和檸檬酸未實(shí)現(xiàn)完全分離；pH 2.2時(shí)7 種有機(jī)酸分離度均大于1.5。有機(jī)酸在水溶液中存在一個(gè)解離平衡，其大部分以解離形式或結(jié)合態(tài)形式存在，以分子形式存在的有機(jī)酸為少部分，所以較低pH值的流動(dòng)相可以促進(jìn)有機(jī)酸向分子形式轉(zhuǎn)換，更利于液相色譜的測定。但若pH值太低，大部分有機(jī)酸保留時(shí)間延長，達(dá)不到快速分離效果，且低pH值的流動(dòng)相對(duì)柱子壽命有影響，所以選擇pH 2.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 流速的選擇

分別考察不同流速對(duì)7 種有機(jī)酸分離效果的影響。結(jié)果表明，流速較小時(shí)，7 種有機(jī)酸的保留時(shí)間延長，分析時(shí)間延長；流速較大時(shí)，7 種有機(jī)酸的保留時(shí)間縮短，分析時(shí)間也縮短。當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，丙酮酸、蘋果酸、乙酸和檸檬酸不能很好地分離；當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，乙酸和檸檬酸不能很好分離；當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí)，7 種有機(jī)酸可以得到較好分離，故選擇流速0.5 mL/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.6 柱溫的選擇

柱溫升高可以降低流動(dòng)相黏度、提高傳質(zhì)效率、縮短分析時(shí)間，但柱溫太高不利于有機(jī)酸的分離且影響色譜柱的使用壽命。本實(shí)驗(yàn)中柱溫對(duì)丙酮酸和草酸的分離效果影響較大，隨著柱溫升高，丙酮酸和草酸的分離度降低；當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí)，丙酮酸和草酸重疊，不能分離；當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，丙酮酸和草酸部分重疊，分離度較差；當(dāng)柱溫為25 ℃時(shí)，丙酮酸和草酸分離度大于1.5，因此實(shí)驗(yàn)中選用溫度25 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限測定結(jié)果

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同質(zhì)量濃度的7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定。以各有機(jī)酸組分的峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比確定檢出限（RSN=3）以及定量限（RSN=10）。如表1所示，7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)范圍為0.999 5～0.999 9，檢出限為0.001～0.014 mg/g，定量限為0.003～0.042 mg/g。

表1 有機(jī)酸組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Calibration equations, correlation coefficients, linear ranges,LODs and LOQs of seven organic acids

2.8 回收率和精密度測定結(jié)果

表2 有機(jī)酸組分的加標(biāo)回收率（n=6）Table 2 Average recoveries of organic acids from spiked wax apple samples (n= 6)

向已知7 種有機(jī)酸含量的蓮霧樣品中分別加入高中低3 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按照1.3.3節(jié)方法處理。每個(gè)加標(biāo)水平平行測定6 次，計(jì)算相應(yīng)組分的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如表2所示。7 種有機(jī)酸的平均加標(biāo)回收率為86.84%～98.86%，RSD均小于5%，說明該方法精密度良好、準(zhǔn)確度高。

2.9 樣品測定結(jié)果

HPLC法測定蓮霧果實(shí)中的有機(jī)酸含量時(shí)，由于各種有機(jī)酸的洗脫速度相近，會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間間隔小。本研究采用超聲輔助加熱法，最大限度地提取了蓮霧果實(shí)中的有機(jī)酸。通過對(duì)色譜條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了利用HPLC法對(duì)蓮霧果實(shí)貯藏期間丙酮酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和富馬酸7 種有機(jī)酸的同時(shí)定量測定。如表3所示，7 種有機(jī)酸含量的RSD均小于5%。

蓮霧果實(shí)在1 2 d 貯藏期間丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸的含量整體呈下降趨勢(shì)，含量變化范圍分別為0.395～0.975、0.030～0.735、0.263～0.702、1.658～5.370 mg/g；蘋果酸、抗壞血酸、富馬酸的含量變化呈現(xiàn)為先上升后期下降的趨勢(shì)，但最高值出現(xiàn)的時(shí)間略有不同。有研究結(jié)果表明，根據(jù)果實(shí)積累的主要有機(jī)酸可將植物果實(shí)分為三大類：蘋果酸型、檸檬酸型和酒石酸型[27]。蘋果[28]、梨[29]、香蕉[30]、李[31]中主要積累的有機(jī)酸為蘋果酸，但同時(shí)也含有大量的琥珀酸和檸檬酸；杏[32]、芒果[33]等果實(shí)中主要積累的有機(jī)酸為檸檬酸，同時(shí)也含有大量的蘋果酸；在葡萄及葡萄酒的研究中發(fā)現(xiàn)，酒石酸是葡萄酒中主要的酸味來源[34]，荔枝[35]中主要積累有機(jī)酸為酒石酸，同時(shí)也積累了大量蘋果酸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蓮霧果實(shí)中7 種有機(jī)酸含量大小依次為蘋果酸＞檸檬酸＞丙酮酸＞乳酸＞乙酸＞富馬酸＞抗壞血酸，蓮霧果實(shí)主要積累的有機(jī)酸為蘋果酸和檸檬酸，這一結(jié)果與李亞等[36]的檢測結(jié)果一致。在貯藏期間，蘋果酸的含量先上升后下降，檸檬酸含量一直下降，所以貯藏期間，蓮霧果實(shí)中有機(jī)酸含量整體呈下降趨勢(shì)。有機(jī)酸作為果實(shí)中主要的風(fēng)味物質(zhì)，其含量與果實(shí)的品質(zhì)密切相關(guān)，因此在貯藏期間蓮霧果實(shí)風(fēng)味變淡，品質(zhì)逐漸下降。

表3 蓮霧果實(shí)貯藏期間7 種有機(jī)酸含量的變化（n=3）Table 3 Changes in the contents of seven organic acids during storage of wax apple (n= 3)

3 結(jié) 論

本研究采用Atlanis T3色譜柱為固定相，0.02 mol/L NaH2PO4（pH 2.2）和甲醇溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測器波長213 nm。各有機(jī)酸組分的線性范圍較寬，相關(guān)系數(shù)為0.999 5～0.999 9，檢出限為0.001～0.014 mg/g，定量限為0.003～0.042 mg/g，RSD低于5%，加標(biāo)回收率為86.84%～98.86%。該方法準(zhǔn)確度高、回收率高，蓮霧果實(shí)樣品無需經(jīng)過復(fù)雜的前處理，即可達(dá)到良好的分離效果。

植物果實(shí)中的有機(jī)酸是決定植物果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)的重要因素，本實(shí)驗(yàn)測定了采后蓮霧貯藏期間7 種有機(jī)酸的含量變化。結(jié)果表明，蓮霧果實(shí)貯藏12 d期間丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸的含量整體呈下降趨勢(shì)，含量變化范圍分別為0.395～0.975、0.030～0.735、0.263～0.702、1.658～5.370 mg/g；蘋果酸、抗壞血酸、富馬酸的含量變化呈先上升后期下降的趨勢(shì)，但最高值出現(xiàn)的時(shí)間略有不同。本研究建立了HPLC法同時(shí)測定采后蓮霧果實(shí)多種有機(jī)酸含量的方法，為進(jìn)一步深入研究蓮霧果實(shí)有機(jī)酸代謝與品質(zhì)劣變的關(guān)系提供了技術(shù)手段，也為其他類水果多種有機(jī)酸研究提供參考。