高效液相色譜-熒光檢測法測定紅肉及其加工肉中唾液酸含量

趙 非，陳寶英，李克峰，王 旭,,*

（1.天津科技大學(xué) 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津桑尼匹克生物科技有限公司，天津 300457）

唾液酸是一類9碳單糖的羧酸鹽。它們在生理上起著多種重要作用，包括分子間的相互作用、神經(jīng)元的外生長和記憶形成、細胞的增殖分化與癌變以及病毒細菌的感染[1-7]。唾液酸的主要代表形式為N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac），是一種酰化（C5氨基處）化合物。另一種常見的形式為N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc），由C5處氨基與羥乙酰基結(jié)合形成（結(jié)構(gòu)見圖1）。唾液酸通常作為糖綴合物的末端殘基被發(fā)現(xiàn)，很少以游離形式出現(xiàn)[8-10]。

圖1 唾液酸結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of sialic acids

近年來，大量流行病學(xué)顯示，紅肉的長期攝入是一種潛在的癌癥危險因素[11-12]。有研究[13]表明Neu5Gc作為紅肉中的一種特殊成分與癌癥的發(fā)生有關(guān)。人類在進化過程中合成Neu5Gc的關(guān)鍵酶CMAH的基因發(fā)生缺失突變，健康人體內(nèi)不能合成Neu5Gc。但是在人體組織和體液中仍然會發(fā)現(xiàn)微量Neu5Gc的存在[14-15]，這是由于通過食物攝入的結(jié)合態(tài)Neu5Gc具有生物可利用性，它可以經(jīng)過體內(nèi)代謝結(jié)合到人體組織中[13,16]。Neu5Gc作為外來抗原與抗Neu5Gc抗體的相互作用可能會引發(fā)炎癥從而增加患癌機率，這也是研究者普遍認為的一個推測[17]。

比色法已用于測定動物組織的唾液酸含量，但此方法缺乏特異性，只能夠測定總唾液酸含量[18-19]。近年來，氣相色譜法[20]、基質(zhì)輔助激光解吸電離-質(zhì)譜法[21]和安培法[22]被應(yīng)用于唾液酸的分析。但是，目前最常用方法是基于柱前衍生化的高效液相色譜法[10]。特別是4,5-亞甲二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽（4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride，DMB），作為一種具有高選擇性和少干擾的衍生化試劑已被廣泛用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或液相色譜-熒光法分析唾液酸[23-24]。對于樣品制備，酸水解是釋放非游離形式唾液酸最常用的方法，通常使用70～90 ℃的溫和酸性條件[25-26]。本研究借助超聲輔助對前處理和衍生化條件進行優(yōu)化，擬建立一種快速測定Neu5Ac和Neu5Gc的高效液相色譜-熒光檢測（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法，對紅肉及其加工制品中的游離和結(jié)合形式的Neu5Ac和Neu5Gc含量進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅肉（牛肉、豬肉、羊肉）、加工肉（火腿）市售；Neu5Gc、Neu5Ac標準品 美國Sigma公司；DMB 阿拉丁試劑（上海）有限公司；鹽酸、乙酸（均為分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氫氧化鈉（分析純） 博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；連二亞硫酸鈉、2-巰基乙醇（均為分析純） 上海阿達瑪斯試劑有限公司；乙腈（色譜級） 美國Fisher公司；所有用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型液相色譜儀（配有熒光、示差、紫外檢測器）美國Agilent公司；Hypersil GOLD C18（250 mmh 4.6 mm，5 μm）色譜柱、真空冷凍干燥儀、振蕩恒溫金屬浴 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mmh 4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；熒光檢測器激發(fā)波長373 nm，發(fā)射波長448 nm；流動相為超純水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～7 min，90%～80% A、10%～20% B；7～9 min，80%～10% A、20%～90% B；9 ～1 2 m i n，1 0% A、9 0% B；1 2 ～1 2.1 m i n，10%～90% A、90%～10% B；12.1～17 min，90% A、10% B；流速1.0 mL/min；進樣體積10 μL。

1.3.2 衍生化反應(yīng)

1.3.2.1 Neu5Ac和Neu5Gc標準品溶液配制

精密稱量10.00 mg的Neu5Ac和Neu5Gc標準品，分別用超純水溶解并定容到10 mL，得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的Neu5Ac和Neu5Gc儲備液，置于-20 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩嶒炛惺褂玫牟煌|(zhì)量濃度標準品溶液均由標準品儲備液稀釋。

1.3.2.2 衍生化試劑溶液

精確稱量29.25 mg DMB衍生化物質(zhì)和24.37 mg連二亞硫酸鈉置于10 mL棕色容量瓶中，加入528 μL 2-巰基乙醇和859 μL乙酸后用超純水定容至10 mL。得13 mmol/L DMB、1.5 mol/L乙酸、14 mmol/L連二亞硫酸鈉、0.75 mol/L 2-巰基乙醇的溶液。

1.3.2.3 衍生化條件

取100 μL樣品或者某一質(zhì)量濃度的標準品與100 μL衍生化試劑溶液混勻，避光、50 ℃混勻振蕩動態(tài)衍生化120 min，轉(zhuǎn)速450 r/min。冰水浴冷卻至室溫，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾進行色譜分析。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 游離態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac提取

準確稱取1 g樣品，加入10 mL超純水勻漿后超聲10 min，在13 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.3.2 結(jié)合態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac含量

準確稱取1 g樣品，加入10 mL超純水進行勻漿，凍干，研磨成粉末。取樣品粉末于離心管中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液2 mL，37 ℃水浴30 min，達到脫乙酰的目的。繼續(xù)加入8 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，80 ℃超聲（功率為180 W）輔助酸解30 min，冰水浴冷卻至室溫。停止反應(yīng)后13 000 r/min離心10 min，收集上清液進行衍生化反應(yīng)并分析。最終測得值減去游離態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac含量即為結(jié)合態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用Excel以及Origin軟件作圖并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生化試劑用量

圖2 衍生化試劑用量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of sample to derivatization reagent ratio

在8 mmol/L的DMB濃度下對衍生化試劑用量進行優(yōu)化[27-28]。取100 μL 1 μg/mL的Neu5Ac和Neu5Gc混合標準品溶液分別在標準品溶液與衍生化試劑體積比9∶1、1∶1、1∶2三個用量下衍生化并進行色譜分析。由圖2可見，當(dāng)在混合標準品溶液與衍生化試劑用量體積比為1∶1時，所測物質(zhì)的峰面積最高，故選用樣品與衍生化試劑比1∶1作為最優(yōu)的衍生化試劑用量。

2.1.2 衍生化試劑濃度

選取4、8、13 mmol/L三個濃度進行DMB衍生化試劑濃度的優(yōu)化[13,29-30]。如圖3所示，在4～13 mmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著DMB試劑濃度的增大，峰面積具有明顯上升的趨勢，即選用13 mmol/L作為衍生化試劑的最優(yōu)濃度。

圖3 衍生化試劑濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of derivatization reagent concentration

2.1.3 衍生化時間

將100 μL 1 μg/mL的Neu5Gc和Neu5Ac混合標準品溶液加入100 μL 13 mmol/L的DMB衍生化試劑，渦旋混勻。避光、50 ℃條件下分別水浴80、100、120、150、180 min。冰水浴冷卻至室溫，過膜進行色譜分析。如圖4所示，80～120 min產(chǎn)物濃度隨時間延長而上升，120～180 min產(chǎn)物濃度變化率減小。因此，選擇120 min作為DMB最佳衍生化時間。

圖4 衍生化時間的優(yōu)化Fig.4 Optimization of derivatization time

2.2 樣品酸解條件的優(yōu)化

2.2.1 酸解試劑的選擇

對比0.1 mol/L鹽酸80 ℃酸解1 h和2 mol/L乙酸80 ℃酸解3 h兩個樣品酸解條件[31-32]，結(jié)果（圖5）表明0.1 mol/L鹽酸酸解耗時短且酸解更完全，故選擇0.1 mol/L鹽酸作為酸解試劑。

圖5 酸解試劑的選擇Fig.5 Selection of the optimal acid hydrolysis reagent

2.2.2 超聲輔助酸解時間的優(yōu)化

樣品依次進行勻漿凍干、脫乙酰并加入酸解試劑，在功率為180 W的超聲輔助下，80 ℃分別酸解10、20、30、40、50 min，冰水浴至室溫后13 000 r/min離心10 min。取100 μL上清液按1.3.2節(jié)進行衍生化并進行色譜分析。結(jié)果（圖6）表明在10～30 min的超聲時間內(nèi)，Neu5Ac和Neu5Gc的峰面積逐漸增加，當(dāng)超聲時間到達30 min后，峰面積趨于平穩(wěn)，無明顯增加。同時，超聲30 min已基本達到常規(guī)水浴1 h的酸解效果，故選用30 min作為超聲輔助酸解時間。

圖6 超聲輔助酸解時間的優(yōu)化Fig.6 Optimization of ultrasound-assisted acidification time

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系及檢出限實驗結(jié)果

將Neu5Ac和Neu5Gc標準品儲備液分別逐級稀釋到0.1、0.5、1、5、10 μg/mL。按照1.3.2節(jié)方法進行衍生化，以3 次峰面積的平均值作為縱坐標，標準品質(zhì)量濃度作為橫坐標，繪制標準曲線。Neu5Ac標準曲線y=335.20x+12.275，R2=0.999 9；Neu5Gc標準曲線y=283.28x+1.042 9，R2=0.999 7。Neu5Ac和Neu5Gc在0.1～10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將標準品溶液繼續(xù)進行倍數(shù)稀釋，衍生化并進行測定，直至被測標準品質(zhì)量濃度所對應(yīng)信噪比為3。Neu5Ac和Neu5Gc檢出限分別為0.003 μg/mL和0.01 μg/mL。

2.3.2 精密度實驗結(jié)果

選取1 μg/mL混合標準品溶液，按1.3.2節(jié)方法進行衍生，重復(fù)進樣6 次，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。Neu5Ac和Neu5Gc兩種物質(zhì)的RSD分別為1.4%和1.2%，該方法精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實驗結(jié)果

取一定體積的Neu5Ac和Neu5Gc儲備液稀釋至0.1、1 μg/mL和10 μg/mL，每個質(zhì)量濃度配制3 個樣本。如表1所示，Neu5Ac和Neu5Gc峰面積的RSD在0.7%～1.8%范圍內(nèi)，該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性實驗（n＝3）Table 1 Repeatability of the method (n= 3)

2.3.4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

同一份1 μg/mL混合標準品溶液，衍生后分別于第0、1、2、3、4、6、8小時測定Neu5Ac和Neu5Gc的峰面積，結(jié)果表明，Neu5Ac和Neu5Gc在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率實驗結(jié)果

取3 份紅肉，分別加入一定量高、中、低3 個不同質(zhì)量濃度的Neu5Ac和Neu5Gc標準品溶液，測定Neu5Ac和Neu5Gc總量，回收率見表2。Neu5Ac和Neu5Gc回收率分別在104.7%～119.7%和91.2%～95.8%范圍內(nèi)，表明樣品處理過程中待測物質(zhì)具有較少損失，該方法回收率良好。

表2 回收率實驗Table 2 Recoveries of Neu5Ac and Neu5Gc from spiked samples

2.4 紅肉及其加工肉中的Neu5Gc和Neu5Ac含量測定結(jié)果

按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)對樣品進行處理后進行檢測，樣品和混合標準品圖譜見圖7，按外標法計算樣品含量。結(jié)果表明，不同紅肉中的Neu5Gc和Neu5Ac含量存在差異，見表3。其中，加工肉（火腿）中的結(jié)合態(tài)Neu5Gc和Neu5Ac含量均最高，分別為（11.23f 2.73）mg/kg和（71.29f 3.32）mg/kg。生鮮紅肉中羊肉的Neu5Ac含量最高，為（51.38f 10.38）mg/kg。本實驗測試結(jié)果與文獻報道數(shù)據(jù)基本一致[13,32]，相關(guān)差異可能源于紅肉部位、來源等方面的不同。

圖7 樣品和標準品圖譜Fig.7 Chromatograms of mixed standards and samples

表3 紅肉及加工肉中Neu5Gc和Neu5Ac的含量Table 3 Contents of Neu5Gc and Neu5Ac in red meat and processed meat products mg/kg

3 結(jié) 論

本研究利用單因素試驗對DMB試劑濃度、用量和衍生化時間進行優(yōu)化，并借助超聲輔助方法對樣品前處理進行優(yōu)化，建立了一種耗時短、效率高的HPLC-FLD方法。較常規(guī)水浴、超聲輔助的方法顯著縮短了樣品前處理時間，從而提高了檢測效率。本方法Neu5Ac和Neu5Gc檢出限分別為0.003 mg/kg和0.01 mg/kg，可滿足含有較低唾液酸含量的樣品檢測。同時，本實驗準確測定了紅肉及加工肉中的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)Neu5Ac和Neu5Gc的含量，對更好地理解紅肉中Neu5Gc和癌癥之間的關(guān)系及日常飲食攝入紅肉的種類選擇和攝入量具有一定的參考價值。